1. Vorbereitung von Reagenzien
- Bereiten Sie 500 mL PBS vor, indem Sie 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4 in ddH2O auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren.
- Bereiten Sie 100 ml RPMI-Medium vor: RPMI-1640-Medium mit L-Alanyl-Glutamin, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml).
- Bereiten Sie 50 mL 0,1 M NaHCO3 in destilliertem Wasser vor. pH-Wert auf 8,1 einstellen, Filter sterilisieren (0,22 μm) und bei 4 °C lagern.
Anmerkung: Bereiten Sie für zwei extrazelluläre Flussanalysatorplatten mit 8 Vertiefungen 250 μl 0,1 M NaHCO3 pH 8,1 vor.
- Bereiten Sie 1 ml 2 M D-Glukose in destilliertem Wasser vor. Filter, sterilisieren (0,22 μm) und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie 100 μl 1 mM Oligomycin A in Ethanol vor. Filter, sterilisieren (0,22 μm) und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie 250 μl 1 M 2-Desoxy-D-glucose (2-DG) in minimalem DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) vor. Auf 37 °C erwärmen und den pH-Wert auf 7,4 einstellen (pH-Messung bei 37 °C durchführen). Filter, sterilisieren (0,22 μm) und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie 100 μl 1 mM FCCP (Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon) in DMSO vor. Filter, sterilisieren (0,22 μm) und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie 100 μl 1 mM Rotenon in Ethanol vor. Filter, sterilisieren (0,22 μm) und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie 100 μl 1 mg/ml Antimycin A in Ethanol vor. Filter, sterilisieren (0,22 μm) und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie kurz vor der Verwendung 10 ml Glykolyse-Stresstestmedium vor. Minimales DMEM auf 37 °C in einem Wasserbad erwärmen und pH-Wert auf 7,4 einstellen (pH-Messung bei 37 °C durchführen).
- Bereiten Sie vor der Verwendung 10 mL Cell Mito Stresstestmedium mit BSA vor. Ergänzen Sie das minimale DMEM mit 2 mM L-Glutamin, 10 mM D-Glucose, 1 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM Pyruvat und 0,1 % BSA (Rinderserumalbumin). Im Wasserbad auf 37 °C erwärmen und den pH-Wert auf 7,4 einstellen (pH-Messung bei 37 °C durchführen).
- Bereiten Sie vor der Verwendung 10 mL Cell Mito Stresstestmedium ohne BSA vor. Ergänzen Sie das minimale DMEM mit 2 mM L-Glutamin, 10 mM D-Glukose, 1 mM HEPES (pH 7,4) und 1 mM Pyruvat. Warm Cell Mito Stresstestmedium ohne BSA auf 37 °C im Wasserbad und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein (pH-Messung bei 37 °C durchführen).
HINWEIS: BSA wird dem Cell Mito Stresstestmedium zugesetzt, da die Zellen besser auf FCCP reagieren, wenn das Medium mit BSA ergänzt wird (es wurden verschiedene Bedingungen getestet). Zum Laden der Ports wird Cell Mito Stresstestmedium ohne BSA verwendet, da der Hersteller die Verwendung von BSA in dem Medium nicht empfiehlt.
2. Kultivierung von mononukleären Zellen über Nacht
HINWEIS: Führen Sie alle Teilschritte in einer sterilen Gewebekulturhaube durch.
- Bereiten Sie zwei T75-Kolben mit 20 mL RPMI vor. In jeden Kolben werden 30 x 106 isolierte mononukleäre Zellen gegeben. Die Zellen werden mit dem Kolben 16–24 h bei 5 % CO2 und 37 °C inkubiert.
3. Vorbereitung von Zellklebstoff-beschichteten Platten
- Beschichten Sie zwei extrazelluläre Flussmittelanalysatorplatten mit 8 Wells.
Anmerkung: Führen Sie die Beschichtung in einer sterilen Gewebekulturhaube durch.
- Geben Sie 2,2 μl Zellklebstoff (Dichte: 2,54 mg/ml) zu 250 μl 0,1 M NaHCO3, pH 8,1, und pipettieren Sie sofort 12,5 μl der Lösung in jede Vertiefung.
Anmerkung: Zellklebstoff-Stofflösungen können sich in ihrer Dichte unterscheiden, passen Sie das Volumen der NaHCO3-Zugabe entsprechend an.
- Lassen Sie die Platten etwa 20 Minuten in der Haube ruhen, saugen Sie dann den Zellkleber ab und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 μl sterilem Wasser. Lassen Sie es bei geöffnetem Deckel in der Haube ruhen, bis die Vertiefungen trocken sind.
- Verwenden Sie die Platten sofort oder lagern Sie bis zu 1 Woche bei 4 °C, wobei der Rand mit Paraffinfolie umwickelt ist, um Kondensation zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Platten in der Haube auf Raumtemperatur (ca. 20 min) erwärmt werden, bevor Sie die Zellen aussäen.
4. Hydratation der Sensorpatrone
HINWEIS: Hydratisieren Sie zwei 8-Well-Kartuschen für extrazelluläre Flussmittelanalysatoren.
- Trennen Sie die Versorgungsplatte und die Sensorpatrone. Legen Sie die Sensorkartusche kopfüber auf den Labortisch.
- Füllen Sie jede Vertiefung der Utility-Platte mit 200 μl Kalibrant. Füllen Sie jeden Graben an der Außenseite der Vertiefungen mit 400 μl Kalibrant.
- Setzen Sie die Sensorkassette wieder auf die Utility-Platte ein, die jetzt das Kalibrant enthält.
- Stellen Sie die Kartuschenbaugruppe über Nacht in einen befeuchteten, CO2 -freien Inkubator mit 37 °C.
- Schalten Sie den extrazellulären Flussanalysator ein und lassen Sie ihn über Nacht auf 37 °C erwärmen.
5. Aussaat von Zellen in mit Zellklebstoff beschichteten Platten
HINWEIS: Verwenden Sie für den Glykolyse-Stresstest das Glykolyse-Stresstest-Medium. Verwenden Sie für den Cell Mito Stresstest das Cell Mito Stresstestmedium mit BSA.
- Keimzellen für den Glykolyse-Stresstest und den Cell Mito Stresstest in getrennten Platten. Für jeden Test sind Zellen aus einem Kolben mit einer Übernachtkultur zu verwenden.
- Zellen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml des entsprechenden Mediums und zählen Sie sie.
- 4 x 106 lebende Zellen werden auf das Endvolumen von 400 μl gegeben (geeignetes Medium verwenden).
- 50 μl der Zellsuspension in die Vertiefungen B-G füllen. Stellen Sie sicher, dass 500.000 Zellen in einer Vertiefung ausgesät werden.
Anmerkung: Es ist entscheidend, genau 500.000 Zellen pro Well zu säen, da keine andere Normalisierung durchgeführt wird. Auf diese Weise können die Ergebnisse verschiedener Patienten verglichen werden. Die optimale Anzahl von Replikaten beträgt sechs, wie hier beschrieben. Die Verwendung von weniger Replikaten wird nicht empfohlen, da sich Primärzellen manchmal fehlerhaft verhalten können.
- Geben Sie 180 μl des entsprechenden Mediums in die Vertiefungen A und H (diese Vertiefungen dienen als Hintergrundkorrektur).
- Die Platte bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, wobei die Bremse auf 1 gestellt ist.
- Geben Sie langsam und vorsichtig 130 μl des geeigneten Mediums in die Vertiefungen B-G in zwei 8-Well-Platten für extrazelluläre Flussmittelanalysatoren. Bestätigen Sie visuell, dass die Zellen stabil am Boden der Vertiefungen haften, indem Sie sie unter dem Mikroskop betrachten.
- Stellen Sie die Platte für 30 Minuten in einen befeuchteten, CO2 -freien Inkubator mit 37 °C.
6. Einlegen der Sensorkassette
- Bereiten Sie für den Glykolyse-Stresstest je 250 μl 100 mM Glukose, 20 μM Oligomycin A und 1 M 2-DG vor, alles in Glykolyse-Stresstestmedium.
- Bereiten Sie für den Cell Mito Stresstest je 250 μl 20 μM Oligomycin A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP und eine Mischung aus 10 μM Rotenon und 10 μg/ml Antimycin A vor, alles in Cell Mito Stresstestmedium ohne BSA.
Anmerkung: Es wird empfohlen, zwei FCCP-Konzentrationen in einem Assay zu injizieren, da nicht genügend Patientenmaterial für die FCCP-Titration vorhanden ist. Trotzdem sollten die Konzentrationen vom Forscher bestimmt werden.
- Laden Sie die Verbindungen wie folgt in die entsprechenden Injektoranschlüsse der Patrone (Tabelle 1):
7. Einrichten des Programms
- Richten Sie das Programm für den Glykolyse-Stresstest wie in Tabelle 2 beschrieben ein.
- Richten Sie für den Cell Mito Stresstest das Programm wie in Tabelle 3 beschrieben ein.
- Starten Sie das Programm. Ersetzen Sie die Kalibrierungsplatte durch die Assay-Platte (wenn Sie dazu aufgefordert werden).
| Hafen | Glykolyse-Stresstest | Cell Mito Stresstest |
| Last auf den Port | Abschließende Konzentration in den Vertiefungen | Last auf den Port | Abschließende Konzentration in den Vertiefungen |
| ein | 20 μL 100 mM Glukose | 10 mM Glukose | 20 μl 20 μM Oligomycin A | 2 μM Oligomycin A |
| Vgl. | 22 μl 20 μM Oligomycin A | 2 μM Oligomycin A | 22 μl 15 μM FCCP | 1,5 μM FCCP |
| C | 25 μl von 1 M 2-DG | 100 mM 2-DG | 25 μl 30 μM FCCP | 4,5 μM FCCP |
| D | X | | 25 μl 10 μM Rotenon und 10 μg/ml Antimycin A | 1 μM Rotenon und 1 μg/ml Antimycin A |
Tabelle 1: Zusammengesetzte Volumina.
| Schritt | Einstellungen |
| Kalibrierung | Automatisch |
| Gleichgewicht | Automatisch |
| Baseline-Messung | Dreimal: Mischen – 3 min, Warten – 0 min, Messen – 3 min |
| Einspeisung des Anschlusses A | Injektion |
| Messung | Dreimal: Mischen – 3 min, Warten – 0 min, Messen – 3 min |
| Einspeisung des Anschlusses B | Injektion |
| Messung | Dreimal: Mischen – 3 min, Warten – 0 min, Messen – 3 min |
| Einspeisung des Anschlusses C | Injektion |
| Messung | Viermal: Mischen – 3 min, Warten – 0 min, Messen – 3 min |
Tabelle 2: Programm für den Glykolyse-Stresstest.
| Schritt | Einstellungen |
| Kalibrierung | Automatisch |
| Gleichgewicht | Automatisch |
| Baseline-Messung | Dreimal: Mischen – 3 min, Warten – 0 min, Messen – 3 min |
| Einspeisung des Anschlusses A | Injektion |
| Messung | Dreimal: Mischen – 3 min, Warten – 0 min, Messen – 3 min |
| Einspeisung des Anschlusses B | Injektion |
| Messung | Dreimal: Mischen – 3 min, Warten – 0 min, Messen – 3 min |
| Einspeisung des Anschlusses C | Injektion |
| Messung | Dreimal: Mischen – 3 min, Warten – 0 min, Messen – 3 min |
| Einspeisung des Anschlusses D | Injektion |
| Messung | Dreimal: Mischen – 3 min, Warten – 0 min, Messen – 3 min |
Tabelle 3: Programm für den Cell Mito Stresstest.
