T-Zell-Anreicherung: Eine Technik zur Isolierung von T-Zellen aus gemischten Zellpopulationen durch magnetische Trennung

Zusammenfassung

Quelle: Nguyen, H. D., et al. Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei der Graft-versus-Host-Krankheit. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video beschreibt die Anreicherung von T-Zellen aus der Milz einer Maus durch Negativselektion mit einem Magnetseparator. Bei der Technik werden die anderen Zellen in der Probe mit Antikörpern oder Liganden, die gegen spezifische Zelloberflächenantigene gerichtet sind, gezielt depletiert.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Tag 1: T-Zellen von den Spendermäusen vorbereiten

1. Verwenden Sie CD45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6 Wildtyp (WT) Mäuse als Spender für T-Zellen.
2. Euthanasieren Sie C57BL/6-Mäuse durch Ersticken mit Kohlendioxid (_{CO 2}) und warten Sie 2-3 Minuten, bis sie bewusstlos sind. Führen Sie bei Bedarf eine Gebärmutterhalsluxation als sekundäre Sterbehilfe durch.
3. Reinigen Sie das Fell und die Haut der Maus gründlich mit 70% Ethanol. Milz und Lymphknoten werden herausgeschnitten und mit einem Spritzenkolben und 40-μm-Netzsieben in eine einzellige Suspension von Splenozyten getrennt. Waschen Sie das Sieb und den Spritzenkolben mit 1 % RPMI (1 % FBS mit RPMI-Medien), um alle Splenozyten zu sammeln.
4. Die Zellsuspension wird bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstands werden 5 mL ACK Lysingpuffer (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7,2) zugegeben. Inkubieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   Anmerkung: Der ACK-Lysepuffer wird zur Lyse roter Blutkörperchen verwendet.
5. Fügen Sie 5 ml mit 1 % RPMI hinzu, um die Lyse zu stoppen. Bei 800 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
6. Bereiten Sie eiskalten MACS-Puffer (Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) vor (0,5 % BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7,2). Entgasen Sie den Puffer vor der Verwendung. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 5 mL MACS-Puffer.
7. Zählen Sie die Splenozyten und suchen Sie mit einem Hämozytometer und 1 % Trypanblau nach lebenden und toten Zellen. Speichern Sie ein Aliquot von 2 x 10⁶ Zellen, um die Reinigungsausbeute mit Durchflusszytometrie zu bewerten.
8. Resuspendieren Sie die Splenozyten in einer Konzentration von 200 x 10⁶/ml in MACS-Puffer. Fügen Sie 0,03 μl Biotin Anti-Maus-Ter-119, 0,03 μl Biotin Anti-Maus-CD11b, 0,03 μl Biotin Anti-Maus-CD45R und 0,03 μl Biotin Anti-Maus-DX5 pro 10⁶ Zellen hinzu. 15 min bei 4 °C inkubieren.
   Anmerkung: Biotin Anti-Maus-Ter-119, Biotin Anti-Maus-CD11b, Biotin Anti-Maus-CD45R und Biotin Anti-Maus-DX5 wurden verwendet, um mit Erythroiden, Granulozyten, B-Zellen bzw. NK-Zellen zu reagieren. Daher werden diese Zelluntergruppen im folgenden Schritt erschöpft.
9. Geben Sie 10 ml eiskalten MACS-Puffer in die Zellsuspension. Bei 800 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
10. Resuspendieren Sie die Zellpellets im MACS-Puffer in einer Konzentration von 100 x 10⁶/ml. Fügen Sie der Splenozytensuspension Anti-Biotin-Mikrokügelchen (0,22 μl/10⁶ Zellen) hinzu. Gut mischen und weitere 15 Minuten bei 4 °C inkubieren. Die Zellsuspension einmal mit 10 mL eiskaltem MACS-Puffer waschen. Bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
11. Setzen Sie eine magnetische Trennsäule in das Magnetfeld. Spülen Sie die Säule mit 3 ml MACS-Puffer. Lassen Sie die Zellsuspension auf die Säule fallen. Sammeln Sie den Durchfluss, der aus ungebundenen, angereicherten T-Zellen besteht, in einem neuen konischen 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die MS-Säule mit 3 mL eiskaltem MACS-Puffer.
    Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Säule leer ist, bevor Sie die Waschschritte durchführen.
12. Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 4 °C bei 800 x g zentrifugiert. Das Zellpellet wird in 5 mL MACS-Puffer resuspendiert.
13. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer in 1% Trypanblau. Bewahren Sie ein Aliquot von 2 x 10⁶ Zellen für eine Reinheitskontrolle mittels Durchflusszytometrie auf.
    Anmerkung: Die durchschnittliche Ausbeute an Milz-T-Zellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, beträgt ~20-25 x 10⁶ Zellen pro Maus.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI 1640	Thermo Fisher Wissenschaftlich	Artikel-Nr.: 11875-093	Medien
MidiMACS	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-042-302	T-Zell-Anreicherung
0,5 M EDTA pH 8,0 100ML	Fisher Scientific	BP2482100	MACS-Puffer
10-fache PBS	Fisher Scientific	Nr. BP3994	MACS-Puffer
Anti-Biotin-Mikroperlen	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-090-485	T-Zell-Anreicherung
Anti-Mensch/Maus CD45R (B220)	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-0452-85	T-Zell-Anreicherung
Anti-Maus CD4 Biotin	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 13-0041-86	T-Zell-Anreicherung
CD11b	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 13-0112-85	T-Zell-Anreicherung
CD25-Biotin	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 13-0251-82	T-Zell-Anreicherung
CD45R	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-0452-82	T-Zell-Anreicherung
CD49b Monoklonaler Antikörper (DX5)-Biotin	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-5971-82	T-Zell-Anreicherung
Anti-Maus TER-119 Biotin	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-5921-85	T-Zell-Anreicherung
Anti-Maus CD45.1 PE	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 12-0900-83	Durchflusszytometrische Analyse
C57BL/6 Mäuse	Der Charles-Fluss	27	Spender/Empfänger
Durchflusszytometrie-Röhrchen	Fisher Scientific	352008	Durchflusszytometrische Analyse
Sieb für Zellen 40 μM	Thermo Fisher Scientific	22363547	Vorbereitung der Zellen