Generierung dendritischer Zellen aus Knochenmark: Eine Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmark der Maus

1. Erzeugen Sie dendritische Zellen aus dem Knochenmark (BM-DCs).

1. Isolierung des Knochenmarks aus den Femuren und Tibias von WT- oder Faktor B (fB^)-/- Mäusen auf dem B6-Hintergrund. Kurz gesagt, entnehmen Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen von beiden Beinen mit einer Zange und einer Schere. Legen Sie sie in eiskalte RPMI-Röhrchen mit 1 % FCS und 100 μl/ml Penicillin/Streptomycin und 2 μm l-Glutamin (1 % RPMI) in konische 50-ml-Röhrchen. Reinigen Sie den Oberschenkelknochen und die Schienbeinknochen gründlich, indem Sie das gesamte Muskelgewebe mit einer Zange und einer Schere entfernen. Übertragen Sie den Femur und die Tibia aus den konischen 50-ml-Röhrchen in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 92 mm und 1 % RPMI. Schneiden Sie mit einer Schere die Enden des Oberschenkelknochens oder des Schienbeins ab. Füllen Sie ein 50-ml-Röhrchen mit 25 mL 1 % RPMI 1640 Medium. Verwenden Sie dies, um eine 3-ml-Spritze, die an einer 26-g-Nadel befestigt ist, mit 3 mL mit 1 % RPMI zu füllen. Führen Sie diese Spritze in den Knochen ein und drücken Sie den Kolben, um das Knochenmark (BM) aus der Kavität in das Entnahmeröhrchen mit 1% RPMI (~3 mL/Knochen) zu spülen. Die Zellen bei 800 x g für 5 min schleudern.
2. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml ACK-Lysingpuffer für die Lyse roter Blutkörperchen. Inkubieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang auf Eis. Geben Sie 10 ml mit 1 % RPMI in die Zellsuspension, um die Lyse zu stoppen, und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 800 x g. Entsorgen Sie den Überstand.
3. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 10 mL Nährmedium (RPMI 1640 mit 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 50 mM β-Mercaptoethanol) und passen Sie das Volumen so an, dass die Endkonzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml erreicht wird.
4. Geben Sie 20 ng/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) zur Zellsuspension. Kultivieren Sie die Knochenmarkzellen in 100 x 15 mm großen Petrischalen bei 37 °C in 5% CO₂ für 6 Tage.
5. Ersetzen Sie an Tag 3 die Hälfte des laufenden Nährmediums (ca. 5 ml) durch frische Medien mit 40 ng/mL GM-CSF.
6. Erwärmen Sie den Nährboden in einem Wasserbad bei 37 °C. Entnehmen Sie etwa 5 ml des Mediums aus den Knochenmarkkulturschalen. Bei 800 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5-ml-Nährmedien mit 40 ng/mL GM-CSF.
7. Geben Sie am 6. Tag der Kultur 25 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS) in das Medium, um die BM-DCs zu reifen. Speichern Sie ein Aliquot von 2 x 10⁶ Zellen, um die Wirksamkeit der DC-Differenzierung durch Durchflusszytometrie zu bestimmen.
8. Sammle gereifte BM-DCs: Verwende Zellheber, um DCs sanft aus den Petrischalen zu kratzen. Sammeln Sie alle Zellsuspensionen in konischen 50-ml-Röhrchen. Bei 800 x g zentrifugieren, 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. Waschen Sie die Zellpellets 3x mit 50 mL eiskaltem PBS. Sparen Sie ca. 2 x 10⁶ BM-DCs für die immunologische Phänotypanalyse mittels Durchflusszytometrie.