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>1. Fixierung, Zelllyse und Chromatinscherung
HINWEIS: Patientenproben und Jurkat-Zellen werden mit einem kommerziell erhältlichen ChIP-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers fixiert und lysiert, mit Modifikationen, wie zuvor beschrieben. Die Fixierung erfolgt unter einer Laminar-Flow-Haube.
- Bereiten Sie ein 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL 37% Formaldehyd, ein 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL 1,25 M Glycin, ein 5 mL Röhrchen mit 4 mL 1x PBS und eine Box mit Eis für die Fixierung der Zellen vor.
- Nach Stimulation der Zellen für die jeweilige Inkubationszeit stimulieren die Zellen durch Zugabe von 32,4 nM Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) und 1 μM Ionomycin. Dann die Zellen 16 h bei 37 °C und 5% CO2 bei geöffnetem Deckel des Röhrchens inkubieren (um eine Kontamination zu vermeiden, kann eine luftdurchlässige Siegelfolie verwendet werden), die 5 mL Röhrchen bei 200 x g für 5 min drehen und die Zellen in 500 μL PBS in den 5 mL Röhrchen resuspendieren.
- Geben Sie 340 μM Formaldehyd (13,5 μl 37 % Formaldehyd) in die Zellen. Nach kurzem Mischen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren die Suspension 2,5 min (Jurkat-Zellen) bzw. 5 min (Patientenprobe) bei Raumtemperatur inkubieren.
Anmerkung: Für die Primärzellen ist eine verlängerte Fixationszeit erforderlich, um eine optimale Scherung zu gewährleisten.
- Fügen Sie 125 mM Glycin (57 μl von 1,25 M Glycin) hinzu, um die Fixierung zu stoppen, und inkubieren Sie weitere 5 Minuten. Legen Sie die Zellen unmittelbar danach auf Eis und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 500 x g. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL eiskaltem PBS à 200 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand jedes Mal durch Aspiration.
Anmerkung: Nach der Fixierung kann das Protokoll pausiert werden. Fixierte Zellen sollten bei -80 °C gelagert werden. Um zu testen, ob das Epitop des Antikörpers, das im folgenden Protokoll verwendet werden soll, nicht durch Fixierung maskiert ist, können zusätzliche Proben für die Analyse mittels SDS-PAGE Gelelektrophorese und Western Blot verwendet werden. Diese Schritte werden mit 100 μg Protein nach Herstellerangaben durchgeführt. Alle αNFAT2-Antikörper werden in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet, der GAPDH-Antikörper in einer Verdünnung von 1:10000. Ein beispielhaftes Bild von fixierten Proben aus Jurkat-Zellen mit geeigneten und ungeeigneten Antikörpern ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL handelsüblichem Lysepuffer 1 durch Auf- und Abpipettieren. Legen Sie dann die Proben auf das Eis auf einen Shaker und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang unter Schütteln.
Anmerkung: Vor der Lyse können die Zellen für 10 s in flüssigem Stickstoff zerlegt werden. Dies ist nützlich für Jurkat-Zellen, sollte aber in primären Patientenproben vermieden werden. Für den Zerfall legen Sie die 5-ml-Röhrchen für 5 s in 5-10 mL flüssigen Stickstoff in ein spezielles Gefäß. Tragen Sie eine Schutzbrille und geeignete Schutzhandschuhe.
- Anschließend zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen den Überstand vorsichtig durch Pipettieren.
- Homogenisieren Sie die Zellen in 5 mL handelsüblichem Lysepuffer 2 durch Auf- und Abpipettieren und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis unter Schütteln. Anschließend zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen den Überstand vorsichtig durch Pipettieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl (Jurkat-Zellen) oder 140 μl (Patientenproben) Scherpuffer 1 mit 1x Proteaseinhibitor (5 μl bzw. 1,4 μl) und inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis.
- Für die Chromatinscherung werden 140 μl der Zellsuspension aus Schritt 1.9 in Ultraschallröhrchen überführt (vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen und wiederholen Sie diesen Schritt, falls dies aufgrund des Probenvolumens erforderlich ist). Legen Sie die Röhrchen bei einer Temperatur von 7 °C in den fokussierten Ultraschallgerät und scheren Sie sie 10 min (Zelllinie) oder 7,5 min (Patientenproben) mit einer durchschnittlichen Einfallsleistung von 9,375 W, um DNA-Fragmente von 200-500 bp zu erhalten.
- Zum Schluss zentrifugieren Sie bei 15700 x g für 10 min bei 4 °C in der kleinen Zentrifuge und sammeln den Überstand in einem neuen 1,5 mL Röhrchen.
- Um die geeigneten Fragmentgrößen zu testen, analysieren Sie 20 μL des gescherten Chromatins mittels Gelelektrophorese in 1,5 % FSME-Agarosegel. Ein beispielhaftes Bild von geschertem Chromatin aus Jurkat-Zellen guter und schlechter Qualität ist in Abbildung 2 dargestellt. An diesem Punkt kann das Protokoll möglicherweise pausiert werden. Geschertes Chromatin sollte bei -80 °C gelagert werden.
