Chromatin-Immunpräzipitationsassay: Eine Technik zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Fuchs, A. R., et al. Ein Chromatin-Immunpräzipitationsassay zur Identifizierung neuer NFAT2-Zielgene bei chronischer lymphatischer Leukämie. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt das Protokoll für den Chromatin-Immunpräzipitations-Assay (ChIP), der eine klassische Technik zum Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen ist. Diese Technik wird verwendet, um Zielgene in menschlichen chronischen lymphatischen Leukämiezellen zu identifizieren.

Protokoll

>1. Chromatin-Immunpräzipitation

HINWEIS: Die Chromatin-Immunpräzipitation wurde mit einem kommerziell erhältlichen ChIP-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Modifikationen durchgeführt.

1. Berechnen Sie die Anzahl der Immunpräzipitationen (70 μl (Jurkat-Zellen) oder 15 μl (Patientenproben) geschertes Chromatin plus einen Antikörper) und bereiten Sie 20 μl Protein-A-beschichtete Kügelchen pro Fällung in einem 1,5-ml-Röhrchen vor. Waschen Sie die Kügelchen in 40 μL 1x ChIP Puffer 1 pro Fällung durch Auf- und Abpipettieren, lassen Sie die Kügelchen 1 min in einem Magnetgestell ruhen und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Führen Sie diesen Schritt insgesamt viermal aus. Eventuell resuspendieren Sie die Perlen im ursprünglichen Volume mit 1x ChIP-Puffer 1.
2. Für die Immunpräzipitation selbst verwenden Sie 10 μg des αNFAT2-Antikörpers (7A6), um NFAT2 mit seinen gebundenen Zielsequenzen einzufangen. Verwenden Sie 2,5 μg eines Kaninchen-IgG-Antikörpers (DA1E) als IgG-Kontrolle. Bereiten Sie die Reaktionen in frischen 1,5-ml-Röhrchen vor, wie in Tabelle 1.
   HINWEIS: Es ist wichtig, einen monoklonalen Antikörper mit hoher Affinität zu verwenden, dessen Epitop während der Fixierung für dieses Protokoll nicht maskiert wird. Polyklonale Antikörper führen zu einer zusätzlichen Variationsstufe, die es erheblich erschwert, die erhaltenen Ergebnisse angemessen zu interpretieren.
3. Die Mischung aus Schritt 1.2 über Nacht bei 4 °C auf einem rotierenden Rad bei 6 U/min inkubieren.
4. Am nächsten Tag werden die Röhrchen 5 s bei 7.000 x g in der kleinen Zentrifuge geschleudert, in einem Magnetgestell 1 min inkubiert und der Überstand durch Aspiration entfernt. Waschen Sie die Kügelchen jeweils einmal mit den Waschpuffern 1, 2, 3 und 4 nacheinander.
5. Dazu werden die Kügelchen in 350 μl Waschpuffer resuspendiert und 5 min bei 4 °C auf einem rotierenden Rad bei 6 U/min inkubiert.
6. Danach die Röhrchen 5 s bei 7000 x g in der kleinen Zentrifuge drehen. Legen Sie sie dann für 1 Minute in ein Magnetgestell, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie den nächsten Waschpuffer hinzu.
7. Nach dem letzten Waschschritt wird der Überstand durch Pipettieren entfernt, die Kügelchen in 100 μl Elutionspuffer 1 aufgenommen und 30 min lang auf einem rotierenden Rad bei 6 U/min inkubiert.
8. Die Röhrchen kurz drehen (5 s bei 7000 x g in der kleinen Zentrifuge) und für 1 min in ein Magnetgestell legen.
9. Übertragen Sie dann den Überstand durch Pipettieren in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 4 μl Elutionspuffer 2 hinzu.
10. Um die Eingangskontrolle zu erstellen, mischen Sie 1 μl des gescherten Chromatins mit 99 μl Elutionspuffer 1 und 4 μl Elutionspuffer 2 (in diesem Aufbau gibt es drei Röhrchen pro Patient: eine Eingangssteuerung, eine IgG-Kontrolle und eine αNFAT2-Probe).
11. Inkubieren Sie die Proben 4 Stunden lang bei 65 °C und 1300 U/min in einem 1,5-ml-Röhrchenschüttler. 100 μl 100 % Isopropanol zugeben, vortexen und die Proben 5 s lang bei 7000 x g in der kleinen Zentrifuge drehen.
12. Resuspendieren Sie die verfügbaren magnetischen Kügelchen durch gründliches Vortexen, geben Sie 10 μl der Kügelchen zu jeder Probe und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad bei 6 U/min.
13. Nach der Inkubation die Röhrchen 5 s bei 7000 x g in der kleinen Zentrifuge drehen und für 1 min in ein Magnetgestell legen. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
14. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 μl Waschpuffer 1. Drehen Sie die Röhrchen zum Mischen um und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad bei 6 U/min.
15. Die Röhrchen 5 s bei 7000 x g in der kleinen Zentrifuge drehen, 1 min in ein Magnetgestell legen und den Überstand durch Pipettieren entfernen. Wiederholen Sie die Schritte 2.13-2.14 mit Waschpuffer 2.
16. Anschließend wird der Waschpuffer durch Aspiration entfernt, die Kügelchen in 55 μl des Elutionspuffers resuspendiert und 15 min bei Raumtemperatur auf dem rotierenden Rad bei 6 U/min inkubiert, um die ausgefällte DNA zu eluieren. Zum Schluss die Röhrchen 5 s bei 7000 x g in der kleinen Zentrifuge drehen, für 1 min in ein Magnetgestell legen und den Überstand in neue 1,5 mL Röhrchen überführen.
    Anmerkung: Hier kann das Protokoll möglicherweise pausiert werden. Die eluierte DNA sollte dann bei -20 °C gelagert werden.

Artikel	Volumen (μL) pro IP
5% BSA	6
100 x Protease-Hemmer	3
5 x ChIP-Puffer 1	56
geschertes Chromatin	x (15 μL oder 70 μL)
Protein A beschichtete magnetische Kügelchen	20
Wasser in ChIP-Sq-Qualität	185-x-y
Antikörper (αNFAT2 oder IgG-Kontrolle)	y (1,09 μl oder 1 μl)
gesamt	270

Tabelle 1: Zeitplan für das Pipettieren der Chromatin-Immunpräzipitation. Die Chromatin-Immunpräzipitation erfolgte durch Vorbereitung der Reaktionen, wie in der Tabelle angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-NFAT2-Antikörper	Alexis	1008505	Klonen 7A6
Anti-NFAT2-Antikörper	Zelluläre Signalübertragung	8032S	Klonen D15F1
Anti-NFAT2-Antikörper ChIP-Qualität	Abcam (Englisch	AB2796	Klonen 7A6
Magnetisches Rack, DynaMag-15 Magnet	Thermo Scientific	12301D	Kann durch ähnliche Instrumente ersetzt werden
iDeal ChIp-seq Kit für Histone	Diagenode	C01010059
Kleine Zentrifuge	Thermo Scientific	Heraeus Fresko 17	Kann durch ähnliche Instrumente ersetzt werden
Schüttler Duomax 1030	Heidolph Instrumente	Artikel-Nr.: 543-32205-00	Kann durch ähnliche Instrumente ersetzt werden
Halt Protease und Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 78440
IRDye 680LT Esel Anti-Kaninchen IgG (H + L), 0,5 mg	LI-COR Biowissenschaften	Tel.: 926-68023
IRDye 800CW Ziege Anti-Maus IgG (H + L), 0,1 mg	LI-COR Biowissenschaften	Tel.: 925-32210
DNA LoBind Röhrchen 1,5 mL	Eppendorf	22431021
FBS überlegen	Merck	Nr. S0615
37 % Formaldehyd p.a., ACS	Roth	4979,1
1 x PBS	Sigma Aldrich	Nr. D8537
M220 Fokussiertes Ultraschallgerät	Kovaris	500295
20X Bolt MES SDS Laufpuffer	Thermo Scientific	Nr. B0002
Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS-10X)	Zelluläre Signalübertragung	#12498
iBlot 2 Gel-Transfergerät	Thermo Scientific	IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, Nitrozellulose, reguläre Größe	Thermo Scientific	Nr. B23001
große Zentrifuge	Eppendorf	5804R	Kann durch ähnliche Instrumente ersetzt werden

) kg