Kultivierung und Ernte von HSPC-Klonen: Eine Methode zur Gewinnung der einzeln sortierten HSPC-Klone

Zusammenfassung

Quelle: Huber, A. R., et al. Charakterisierung der Mutationslast und der klonalen Zusammensetzung des menschlichen Blutes. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Isolierung von HSPCs aus dem Knochenmark und deren Sortierung mit einer fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechnik, die eine Methode zur Gewinnung von einzeln sortierten HSPCs ist. Wir kultivieren diese sortierten Zellen, um HSPC-Klone zu erhalten.

Protokoll

1. HSPC-Isolierung, Sortierung und Kultur

Bei
1. 1–2 x 10⁷ mononukleäre Zellen für 5 min bei 350 x g herunterschleudern und in 50 μl FACS-Puffer resuspendieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl Anti-CD3-Färbelösung (1:100 Verdünnung des Anti-CD-Antikörpers in FACS-Puffer). Übertragen Sie die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Bei der Sortierung mit >2 x 10⁷ Zellen ist das Volumen der Antikörpermischung und des FACS-Puffers entsprechend zu erhöhen.
2. Bereiten Sie 50 μl 2x HSC-Färbemischung gemäß dem Rezept in Tabelle 1 vor
3. Mischen Sie 50 μl Zelllösung mit der vorbereiteten HSC-Färbemischung und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) oder 1 h auf Eis, damit die Antikörper binden können.
4. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml FACS-Puffer und Pellet, indem Sie 5 Minuten lang bei 350 x g zentrifugieren.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl FACS-Puffer und filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit 35 μm-Zellsieb, um Zellklumpen vor der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) zu entfernen.
6. Bereiten Sie 25 ml HSPC-Nährmedium vor, bestehend aus 1x SFEM-Medium, ergänzt mit 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6 und 100 ng/mL Antibiotikaformulierung (siehe Materialtabelle).
7. Füllen Sie eine 384-Well-Zellkulturplatte mit 75 μl HSPC-Kulturmedium in jede Well.
   HINWEIS: Um eine Verdunstung des Mediums in den äußeren Vertiefungen zu verhindern, füllen Sie die äußeren Vertiefungen mit 75 μl sterilem Wasser oder PBS und verwenden Sie diese Vertiefungen nicht zur Zellsortierung.
8. Sortierung einzelner HSPCs
   1. Legen Sie die Gates für die HSPC-Sortierung auf der Grundlage einer ungefärbten Kontrolle (einfach sortierte HSCs) und 10.000 Zellen aus der gefärbten Probe fest. Ein repräsentatives Ergebnis für das Setzen von Gattern ist in Abbildung 1 dargestellt. Gate für einzelne Zellen, indem Sie ein Gate um den linearen Anteil an FSC-Höhe vs. FSC-Fläche zeichnen. Verwenden Sie die ungefärbte Kontrollfraktion, um das Tor für ^die Abstammungsfraktion zu zeichnen. Zeichnen Sie Gates für CD34⁺-Zellen und charakterisieren Sie diese Untergruppe weiter, indem Sie ein spezifisches Gate für CD38-CD45RA-Zellen setzen.
   2. Legen Sie die 384-Well-Platte in die FACS-Maschine ein und sortieren Sie die einzelnen Zellen.
      HINWEIS: Wenn dies auf die FACS-Maschine zutrifft, schalten Sie die Option zum Beibehalten der Indexsortierungsdaten ein, um die erneute Verfolgung der sortierten Zellen zu ermöglichen.
9. Kultivierung von sortenreinen HSCs
   1. Übertragen Sie die 384-Well-Platte direkt in einen befeuchteten 37 °C-Inkubator mit 5 % CO₂,
      Anmerkung: Um eine Verdunstung während der Kultur zu verhindern, wickeln Sie die 384-Well-Kulturplatte (mit Deckel) in transparente Polyethylenfolie ein.
   2. Bewahren Sie die 384-Well-Platte 3–4 Wochen im Inkubator auf, bis sichtbare Klone erscheinen. Repräsentative Bilder der klonalen Kultur sind in Abbildung 2 dargestellt. Je nach Zustand des Einsatzmaterials dehnen sich 5 % bis 30 % der sortierten Zellen klonal aus.

kg kg

Antikörper	Volumen [μL]
BV421-CD34	5
FITC-Lineage Mix (CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	arabische Ziffer
Schützenpanzer CD90	0,5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE/Cy7- CD49f	1
FITC -CD16	1
FITC-CD11	5
FACS-Puffer	25,5

Tabelle 1: HSC-Sortiermischung.Abgebildet ist eine Tabelle, die die Verdünnungen der Antikörper angibt, die zur Sortierung der HSCs verwendet wurden.

2. HSPC-Klone ernten

1. Bestimmen Sie nach 4 Wochen Kultivierung, welche Vertiefungen einen Zusammenfluss von 30 % oder mehr aufweisen.
2. Füllen Sie (für jeden klonalen Auswuchs) 1,5 ml-Mikroröhrchen mit 1 mL 1 % BSA in PBS vor und markieren Sie das Röhrchen entsprechend der entsprechenden Vertiefung.
3. Befeuchten Sie eine Pipettenspitze mit 1 % BSA in PBS, um die Anzahl der Zellen zu minimieren, die an der Pipettenspitze haften.
4. Pipettieren Sie das Medium in der Vertiefung heftig (mindestens 5 Mal) mit einer 200-μl-Pipette (eingestellt auf 75 μl) nach oben/unten und kratzen Sie den Boden der Vertiefung ab, um die Zellen in der Vertiefung zu lösen, und sammeln Sie die Zellsuspension in dem markierten Mikroröhrchen, das der Vertiefung entspricht.
5. Nehmen Sie 75 μl frisches 1 % BSA in PBS auf und wiederholen Sie das Pipettieren in der Vertiefung, um eine maximale Aufnahme der Zellen zu gewährleisten.
   HINWEIS: Klonal kultivierte Zellen können am Boden der Vertiefung haften bleiben. Inspizieren Sie die Vertiefungen mit einem Standard-Inverslichtmikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen entnommen wurden.
6. Wenn alle Vertiefungen mit >30 % Konfluenz geerntet wurden, setzen Sie die 384-Well-Platte wieder in den Inkubator ein. Klonale Kulturen können sich bis zu 5 Wochen lang vermehren.
7. Schleudern Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 350 x g herunter. Ein kleines Kügelchen sollte sichtbar sein.
8. Entfernen Sie vorsichtig alle bis auf etwa 5 μl Überstand. Zellpellets können bei -20 °C eingefroren und mehrere Monate gelagert werden, bevor sie in die DNA isoliert werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Flussdiagramm, das das experimentelle Vorgehen auf der Grundlage des Eingangsmaterials darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CD11c FITC	BioLegende	301603	Klonen 3.9
CD16 FITC	BioLegende	302005	Klonen 3G8
CD3 BV650	BioLegende	300467	Klonen von UCHT1
CD34 BV421	BioLegende	343609	Nr. 561
CD38 PE	BioLegende	303505	HIT2 klonen
CD45RA PerCP/Cy5.5	BioLegende	304121	HI100 klonen
CD49f PE/Cy7	BioLegende	313621	GoH3 klonen
CD90 Schützenpanzer	BioLegende	328113	Klonen 5E10
Cell Strainer 5 mL Röhrchen	Corning	352235
CELLSTAR Platte, 384w, 130 μL, F-Boden, TC, Deckel	Greiner	781182
Humaner Flt3-Ligand, Premium-Qualität	Miltenyi Biotech	Tel.: 130-096-479	Rekonstitution in Einmal-Aliquoten (25 μl) mit 100 μg/ml in 0,1 % BSA in PBS
Humane rekombinante IL-3 (E. coli-exprimiert)	Technologien für Stammzellen	Artikel-Nr.: 78040.1	Rekonstitution in Einmal-Aliquoten (2,5 μl) mit 100 μg/ml in 0,1 % BSA in PBS
Humane rekombinante IL-6 (E. coli-exprimiert)	Technologien für Stammzellen	Artikel-Nr.: 78050.1	Rekonstitution in Einmal-Aliquoten (5 μl) mit 100 μg/ml in 0,1 % BSA in PBS
Humanes SCF, Premium-Qualität	Miltenyi Biotech	Tel.: 130-096-695	Rekonstitution in Einmal-Aliquoten (25 μl) mit 100 μg/ml in 0,1 % BSA in PBS
Humanes TPO, Premium-Qualität	Miltenyi Biotech	Tel.: 130-095-752	Rekonstitution in Einmal-Aliquoten (12,5 μl) mit 100 μg/ml in 0,1 % BSA in PBS
Abstammung (CD3/14/19/20/56) FITC	BioLegende	348701	Klone: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Pbs			Hergestellt in der Einrichtung des Instituts. Auch kommerziell erhältliche PBS können verwendet werden
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Antibiotika-Formulierung