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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
Isolierung von c-Kit+ Zellen aus dem Knochenmark
- Opfern Sie die Mäuse gemäß den institutionellen Vorgaben.
HINWEIS: Hier wurden die Mäuse Kohlendioxid (CO2) mit einer gemäß der von der AVMA empfohlenen Flussrate ausgesetzt, bis der Tod durch den Stopp der Atmung und des Herzschlags bestimmt wurde, gefolgt von einer Zervixluxation.
- Entnehmen Sie der Maus die Beinknochen – zwei Oberschenkelknochen, zwei Schienbeine, zwei Beckenknochen. Reinigen Sie alle Gewebe von den Knochen, indem Sie sie mit einem Skalpell abkratzen. Legen Sie die Beinknochen in kaltes 1x PBS auf Eis – 5 mL in ein 15 mL Röhrchen. Gießen Sie den Inhalt der Tube in einen Mörser und zerdrücken Sie ihn mit einem Stößel.
- Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einer Pipette durch ein 70-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Schraubverschlussröhrchen, an dem eine 10-ml-Pipette befestigt ist. Waschen Sie den Mörser und den Stößel mehrmals mit kaltem 1x PBS, sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in das 50-ml-Röhrchen. Knochenmark bei 1.200 x g bei 4 °C für 5 min herunterschleudern. Entfernen Sie den Überstand über ein Vakuum mit einer aufgesetzten Glaspipette. Suspendieren Sie das Zellpellet mit einer Pipette in 5 mL 1x PBS.
- Geben Sie mit einer Pipette langsam suspendiertes Knochenmark auf die Oberseite von 5 ml Polysaccharose bei Raumtemperatur (die Temperatur ist kritisch) und achten Sie dabei sehr darauf, die Grenzfläche nicht zu stören. Bei 400 x g bei Raumtemperatur 20 min bei ausgeschalteter Bremse schleudern.
- Entnehmen Sie die Grenzfläche der trüben mononukleären Zellen (TMNC) mit einer Pipette und geben Sie sie in ein neues 15-ml-Röhrchen. Bringen Sie das Volumen auf 10 mL mit 1x PBS für den Waschgang, nehmen Sie 20 μl zum Zählen und schleudern Sie bei 1.200 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet für Schritt 4.6.1 auf Eis auf.
- Führen Sie die Isolierung der c-Kit+-Zellen durch.
- Befolgen Sie ein Mikrobead-Kit-Protokoll für die Isolierung der c-Kit+-Zellen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 80 μL 1x PBS + EDTA + BSA auf 107 Zellen. Füge der Zellsuspension 20 μl CD117 MicroBeads/107 Zellen insgesamt hinzu. Durch Vortexen gut mischen und 10 min bei 4 °C inkubieren. Das Volumen durch Zugabe von 1x PBS + EDTA + BSA auf 10 mL erhöhen und bei 1.200 x g bei 4 °C 5 min schleudern.
- Entfernen Sie den Überstand über ein Vakuum und suspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL/10 insgesamt8 Zellen in 1x PBS + EDTA + BSA. Fügen Sie unter Verwendung des Magnetstativs mit der angebrachten Magnetsäule 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA hinzu und lassen Sie es durch die Schwerkraft in ein 15-ml-Sammelröhrchen fließen.
- Sobald die erste Pufferzugabe die Säule durchlaufen hat, geben Sie die Zellsuspension in die Säule, so dass sie durch die Schwerkraft in das 15-ml-Sammelröhrchen fließen kann. Dieser Durchfluss ist die unerwünschte Zellfraktion.
- Waschen Sie die Säule jedes Mal 3 Mal mit 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA, damit sie durch die Schwerkraft in das Sammelröhrchen fließen kann. Nehmen Sie die Säule vom Magneten und setzen Sie sie auf die Oberseite eines 15-ml-Röhrchens.
- Fügen Sie 5 mL 1x PBS + EDTA + BSA hinzu und spülen Sie es sofort mit dem mit der Säule gelieferten Kolben. Entfernen Sie den Kolben und wiederholen Sie die Spülung mit zusätzlichen 5 mL 1x PBS + EDTA + BSA. Zählen Sie die Zellen im Gesamtvolumen mit Standardmethoden.
- Schleudern Sie die Zellen bei 1.200 x g bei 4 °C für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in vollständiger IMDM (IMDM + 10 % FBS + IL-6 [10 ng/ml] + mSCF [50 ng/ml] + FLT3-Ligand [20 ng/ml] + IL-3 [10 ng/ml]) für die Kultur. Kultivieren Sie diese Zellen über Nacht in 2 x 106 Zellen/1 ml IMDM-Komplettmedium, indem Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator legen.