Retrovirale vermittelte Transduktion: Eine Methode, um ein Zielgen in Krebszellen einzuführen

Zusammenfassung

Quelle: Kesarwani, M., et al. Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in der Onkogenabhängigkeit. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt das Protokoll für die genetische Validierung durch die Übertragung von Zielgenen mit Hilfe von Retroviren in Zelllinien mit chronischer myeloischer Leukämie. Die Retroviren fungieren als Vermittler, um genetisches Material durch den als Transduktion bezeichneten Prozess in die Leukämiezelle zu übertragen, der eine langfristige Expression des Zielgens ermöglicht. Diese Methode kann auf beliebige Zielzellen zur genetischen Validierung und therapeutischen Entwicklung angewendet werden.

Protokoll

>1. Transduktion

1. Retrovirale Plasmidtransfektion
   1. Tauen Sie HEK293-Zellen am Vormittag in einem auf 37 °C eingestellten Wasserbad frisch auf. Drehen Sie das Kryoröhrchen mit den HEK-Zellen bei 435 x g bei Raumtemperatur für 3 Minuten. Entfernen Sie den Überstand über ein Vakuum und suspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM, das mit 10 % FBS, Penicillin, Streptomycin und Glutamin ergänzt ist.
   2. Zählen Sie die Zellen und geben Sie das entsprechende Volumen in eine 10 cm lange behandelte Schale (~4 x 10⁶ HEK293T Zellen). Geben Sie 14 mL des DMEM 10-Mediums in die Schale und mischen Sie es gut, indem Sie es auf und ab schieben, um eine gleichmäßige Verteilung zu erzielen. Stellen Sie das Gericht über Nacht in einen 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator.
   3. Überprüfen Sie am nächsten Morgen den Zusammenfluss der Zellen unter einem inversen Lichtmikroskop (50% oder mehr funktionieren gut).
   4. Kombinieren Sie die DNA (gewünschtes retrovirales Plasmid), PclEco (Verpackungsplasmid), 2 M CaCl₂ und H₂0 in einem 1,5 mL Röhrchen (= 500 μL) mit einer Mikropipette in folgenden Mengen: 7,5 μg DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 μg pCLeco, 62 μL 2 M CaCl₂ und Wasser bis zu einem Endvolumen von 500 μL. Geben Sie 500 μL 2x HBS in ein weiteres 1,5 mL Röhrchen.
   5. Geben Sie die DNA-Mischung während des Mischens tropfenweise in das 1,5-ml-Röhrchen mit 500 μl 2x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES und 1,5 mM Na₂HPO₄). Erreichen Sie dies, indem Sie einen Wirbel auf die niedrigste Geschwindigkeit einstellen und das HBS-Rohr darauf halten, um konstant zu mischen, während Sie die Transfektionsmischung hinzufügen.
   6. Lassen Sie die Transfektionsmischung 20–30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie während der Inkubation 25 nM Chloroquin in die HEK-Zellen und legen Sie sie wieder in den Inkubator. Geben Sie nach der Inkubation die Transfektionsmischung tropfenweise zu den HEK-Zellen und schwenken Sie dann das Medium vorsichtig, um die Transfektionsmischung auf der Platte zu mischen.
   7. Inkubieren Sie die Zellen mit der Mischung für ~8 h in einem 37 °C, 5% CO₂ -Inkubator. Wechseln Sie das Medium auf diesen Zellen, indem Sie sehr langsam 14 ml frisches DMEM 10-Medium hinzufügen. Das langsame Pipettieren an der Wand der Schale hilft, ein Abstreifen der HEK-Zellen zu verhindern. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht im 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂
   .
   8. Sammeln Sie den Virusüberstand mit einer 10-ml-Spritze, ziehen Sie den Überstand in die Spritze und setzen Sie den 0,45-μm-Spritzenfilter auf. Tauchen Sie den Virusüberstand in ein neues Sammelröhrchen. Nehmen Sie die erste Sammlung von Virusüberständen ~16 h später.
2. Fibronektin-Viruskonzentration und -transduktion
   1. Geben Sie 2 ml eines rekombinanten humanen Fibronektinfragments von 0,1 mg in 1x PBS auf unbehandelte 6-Well-Kulturplatten. Bereiten Sie so viel Fibronektin vor, wie Sie benötigen, was von der Anzahl der Zellen und Genotypen abhängt. Eine Vertiefung kann ausreichend 10 Millionen c-Kit+ Zellen transduzieren. Die Platte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   2. Am nächsten Tag nehmen Sie das Fibronektin mit einer Pipette aus den Vertiefungen, pipettieren Sie 2 ml steriles 2%iges BSA in 1x PBS, um die Platte zu blockieren, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das BSA über ein Vakuum und waschen Sie es gründlich, indem Sie 2 mL 1x PBS pipettieren und dann über ein Vakuum entfernen.
   3. Frisch gesammelter und filtrierter (bei 0,45 μm) Virusüberstand bis zu 5 ml ist sofort zuzugeben. Zentrifugieren Sie bei 435 x g bei 32 °C für 2 h. Entfernen Sie den Überstand über ein Vakuum und wiederholen Sie diesen Schritt mit zusätzlichem, frisch gesammeltem Virusüberstand und schleudern Sie erneut. Entfernen Sie den Überstand durch ein Vakuum und waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie 2 mL 1x PBS hinzufügen; Entfernen Sie es dann über ein Vakuum.
   4. Fügen Sie die c-Kit+ Mauszellen hinzu, die über Nacht kultiviert wurden, indem Sie die Zellen herunterschleudern und das Pellet in vollständigem IMDM resuspendieren, um es zu kultivieren. Kultivieren Sie diese Zellen über Nacht in 2 x 10⁶ Zellen/1 ml IMDM-Vollmedium, indem Sie sie in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂) in die mit Viren beschichteten Vertiefungen geben, indem Sie die Zellsuspensionen gut mischen und in die nun viral konzentrierte Fibronektinplatte pipettieren. Bei 1.200 x g bei 25 °C 90 min schleudern. Legen Sie die Zellen in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2
   .
   5. 48 h nach der Transduktion die Zellen durch Zentrifugation bei 1.200 x g bei 4 °C für 5 min pelletieren und in FACS-Puffer #1 (1x PBS + 0,5% BSA) auf 6 x 10⁶/mL resuspendieren. Bestimmen Sie den Prozentsatz der BCR-ABL1-positiven Zellen, indem Sie den Prozentsatz der YFP-positiven Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie messen.
   6. Erfassen Sie Ereignisse mit der Standardprozedur. Zuerst gaten Sie die lebenden Zellen basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung. Gaten Sie dann die YFP-positiven lebenden Zellen mit Ausnahme der YFP-negativen Zellen, die durch die Negativkontrolle bestimmt wurden (Abbildung 1).

Ergebnisse

Abbildung 1: FACS, das die Häufigkeit von YFP+-Zellen aus dem Blut einer transplantierten und einer WT-Maus zeigt (Negativkontrolle). In den oberen Bereichen wird ein Streudiagramm der Zellen und des Gatings angezeigt. Die unteren Felder zeigen Histogramme von YFP vs. Side Scatter. Zellen mit einem MFI von >10³ wurden als YFP+ betrac...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Cellgro (Verhornung)	15-013-CV
RetroNectin Rekombinantes humanes Fibronektin-Fragment	Takara	T100B
FBS	Atlanta biologisch	Nr. S11150
Penn/Streptokokken	Cellgro (Verhornung)	30-002-CI
L-Glutamin	Cellgro (Verhornung)	Artikel-Nr.: 25-005-CL	5 mg/mL Vorrat in Wasser
HEPES	Sigma	Nr. H7006
Pbs	Corning	21040CV
Na2HPO4.7H2O	Sigma	Nr. S9390
Calciumchlorid	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
Edta	Ambion	AM9261
Bsa	Sigma	Nr. A7906
Humaner Langzeitkultur-Initiierungs-Zellassay	Stemp Zelltechnologien
TC-10 automatisierter Zellzähler	Bio-RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	Hergestellt im Haus
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Hergestellt im Haus
ROSACreERT2	Jackson-Labor
C57Bl/6	Jackson-Labor
CML-CD34+ und normale CD34+ Zellen	Universitätskrankenhaus, Universität von Cincinnati
LSR II (FACS-Analysator)	Bd
Fortessa I (FACS-Analysator)	Bd
FACSAriaII (FACS-Sortierer)	Bd
NAPCO Serie 8000 WJ CO2-Inkubator	Thermowissenschaftlich
Ausschwingrotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
1/2 cc Lo-Dose u-100 Insulinspritze 28 G1/2	Becton Dickinson	Becton Dickinson
Hydrocortison-Natrium-Hemisuccinat	Technologien für Stammzellen	7904
GM-CSF	Prospec	CYT-221
G-SCF	Prospec	CYT-220
Menschliches IL-3	Prospec	CYT-210
menschliches SCF	Prospec	CYT-255
Erythropoiein	Amgen	Artikel-Nr.: 5513-267-10
BD Perm/Wash (Permeabilisierung und Waschlösung für Phospho-Flow)	Bd	554723
BD Cytofix/Cytoperm (Fixier- und Permeabilisierungslösung)	Bd	554714
BD Pharm Lyse	Bd	555899
70 μm Zellstariner aus Nylon	Becton Dickinson	Artikel-Nr.: 352350
0,45 μM Acro-Scheibenfilter	Bahrtuch	2016-10