CFU-Assay auf Methylcellulose-Basis: Eine Methode zur Bestimmung der Wirkung von Anti-Krebs-Wirkstoffen auf die Koloniebildung in leukämischen Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Kesarwani, M., et al. Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in der Onkogenabhängigkeit. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt das Protokoll für Methylcellulose-basierte Koloniebildungseinheiten oder CFU-Assays, die helfen, die Anzahl der Kolonien zu identifizieren und zu zählen, die von leukämischen Zellen als Reaktion auf die Behandlung mit Antikrebspräparaten gebildet werden.

Protokoll

1. Assays für koloniebildende Einheiten

1. Tauen Sie die Methylcellulose mit Zytokinen für Maus bei Raumtemperatur für 1–2 h auf. Aliquotieren Sie 3 ml Methylcellulose in einem FACS-Röhrchen mit einer 5-ml-Spritze ohne Nadel. Sortieren Sie die YFP-positiven Zellen auf einem Zellsortierer.
2. Schleudern Sie die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet in IMDM-Vollmedium. Zählen Sie die zu plattierenden Zellen und verdünnen Sie sie, um 5.000 YFP-positive Zellen in 100 μl IMDM-Komplettmedium zu erhalten.
3. Geben Sie 100 μl der Zellsuspension mit 5.000 YFP-positiven Zellen und den entsprechenden Inhibitoren zu 3 ml Methylcellulose. Vortex auf hoher Stufe, um es 10–30 s lang zu mischen.
4. Nachdem die meisten Luftblasen entwichen sind, verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um 1 ml des Mediums in drei replizierte 3-cm-Platten zu füllen, indem Sie das Medium auf einer Seite ausstoßen und die Platte langsam in kreisenden Bewegungen kippen, damit sie sich gleichmäßig verteilt.
5. Die endgültige Konzentration der zu verwendenden Inhibitoren ist Imatinib bei 3 μM, DFC bei 0,2 μM und BCI bei 0,5 μM, allein oder in Kombinationen. Wo immer es angebracht ist, c-Fos löschen, indem die Zellen mit 4-Hydroxytamoxifen (1 μg/ml) überzogen werden, das der Methylcellulose zugesetzt wird.
6. Legen Sie die Platten nach dem Anrichten in eine große Petrischale, in deren Mitte sich eine offene Schale mit 2 ml sterilem Wasser befindet. Decken Sie die große Petrischale ab und inkubieren Sie vorsichtig im 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂. Notieren Sie die Anzahl der Völker nach einer Woche Plattierung, indem Sie die Gesamtzahl der Völker unter einem Mikroskop zählen.
7. Analysieren Sie einige Kolonien von geeigneten Platten auf c-Fos-Deletion mittels PCR. Sammle die Kolonien, indem du sie mit einer P1000-Spitze aussaugst. Entfernen Sie die Zellen in 500 μl 1x PBS, indem Sie die Spitze mehrmals im PBS waschen. Schleudern Sie die Zellsuspensionen 1 Minute lang bei 6.000 x g und extrahieren Sie die DNA aus dem Zellpellet mit einem genomischen DNA-Isolationskit.
8. Verwenden Sie die genomische DNA für die PCR mit den Primern mFos-FP3 und mFos-RP5. Analysieren Sie die PCR-Produkte auf einem 2%igen Agarose-Gel und bilden Sie sie mit einem Gel-Dokumentationssystem ab.
9. Für eine grafische Darstellung der Völker färben Sie die Völker mit Iodnitrotetrazoliumchlorid. Lösen Sie 10 mg Iodnitrotetrazoliumchlorid in 10 ml Wasser, um eine Lösung von 1 mg/ml zu erhalten. Filter: Sterilisieren Sie die Lösung mit einem Luer-Lock mit einem 0,2-μm-Filter, der unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube an einer 10-ml-Spritze befestigt ist.
10. Geben Sie in der Gewebekulturhaube 100 μl Färbelösung tropfenweise um die CFU-Platte; achten Sie darauf, dass Sie nicht verrutschen oder die Kolonien stören. Inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem 37 °C und 5 % CO₂ -Zellkultur-Inkubator. Die Bienenvölker färben sich dunkelrotbraun. Machen Sie auf einem weißen Hintergrund in der sterilen Gewebekulturhaube Fotos von der verfärbten CFU-Platte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
IMDM	Cellgro (Verhornung)	15-016-CVR
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose für Maus-KBE)	Stammzelle	3434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	Nr. H6278
Rekombinante murine SCF	Prospec	CYT-275
Rekombinanter muriner Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Rekombinante Maus IL-6	Prospec	CYT-350
Rekombinante Maus IL-7	Peprotech	Nr. 217-17
Dfc	LKT Laboratories Inc.	Nr. D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laborator	I-5508
1x PBS	Cellgro (Verhornung)	21-040-CV
1/2 cc Lo-Dose u-100 Insulinspritze 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Iodnitrotetrazoliumchlorid	Sigma	Nr. I10406
Instrumente
NAPCO Serie 8000 WJ CO2-Inkubator	Thermowissenschaftlich
Ausschwingrotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
C-1000 Thermocycler	Bio-RAD
ChemiDoc Imaging System (Bildgebungssystem für Gele und Western Blots)	Bio-RAD	17001401
Mäuse
ROSACreERT2	Jackson-Labor
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/	Hergestellt im Haus
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Hergestellt im Haus