Negative immunomagnetische Selektion: Eine Methode zur Aufreinigung von B-Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Abstract

Quelle: Serra S. et al. HPLC-basierter Assay zur Überwachung des extrazellulären Nukleotid-/Nukleosidstoffwechsels in menschlichen chronischen lymphatischen Leukämiezellen. J. Vis. Exp. (2016)

Das Video erklärt eine Methode zur Reinigung von B-Zellen durch immunomagnetisches Targeting und Trennung von der Suspension der mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Bei der Methode werden unerwünschte Zelltypen mit spezifischen Antikörpern oder Liganden (die an magnetische Partikel gebunden sind) markiert, die auf bestimmte Zelloberflächenproteine abzielen, die durch magnetische Trennung aus der heterogenen Zellsuspension entfernt werden sollen.

Protocol

1. Reinigung von leukämischen B-Zellen durch negative Isolierung

1. Resuspendieren Sie 10⁷ PBMCs/ml in PBS 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), 2 mM EDTA, pH 7,4 (Isolationspuffer).
2. 10 μg monoklonale Maus-Anti-CD3-, -CD14- und -CD16-Primärantikörper für 10⁷ Zellen zugeben und 30 min bei 4 °C inkubieren.
3. Waschen Sie die Zellen mit dem Isolationspuffer und zentrifugieren Sie sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
4. Die Zellen werden im Isolationspuffer bei 10⁷ PBMCs/ml resuspendiert.
5. Vor der Inkubation mit den Zellen resuspendieren Sie die Anti-Maus-IgG-Magnetkügelchen von Schafen in der Durchstechflasche. 100 μl Kügelchen pro 10^{bis 7} Zellen in ein Röhrchen geben.
6. Fügen Sie 1 ml Isolationspuffer hinzu und stellen Sie das Röhrchen für 1 Minute in eine Magnethalterung. Entsorgen Sie den Überstand mit einer 5-ml-Pipette.
7. Nehmen Sie das Röhrchen vom Magneten und suspendieren Sie die gewaschenen Kügelchen wieder in 100 μl Isolationspuffer.
8. Inkubieren Sie 10⁷ Zellen mit 100 μl magnetischen Kügelchen für 30 min bei 4 °C durch leichtes Kippen und Drehen.
9. Legen Sie das Röhrchen für 2 min in den Magnethalter und geben Sie den Überstand mit den ungebundenen CD19⁺/CD5⁺-Zellen mit einer 5-ml-Pipette in ein frisches Röhrchen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Menschliches Blut
gereinigtes Anti-CD3, -CD14, -CD16	Hergestellt im eigenen Haus		monoklonal für Maus
Dynabeads Anti-Maus-IgG für Schafe	Invitrogen	Artikel-Nr.: 11031
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Amresco	E404-200TABS	Tabletten
Rinderserumalbumin (BSA)	ID-Biografie	1000-70	Standardqualität
Isolations-Puffer			PBS 0,1 % BSA, 2 mM EDTA, pH 7,4
DynaMag-15 Magnet	Invitrogen	12301D	Dynal magnetischer Bead-Abscheider