1. Herstellung von Standard- und Inhibitor-Stammlösungen
- Zur Herstellung von AMP wiegen Sie 0,00345 g AMP ab und lösen Sie es in 5 ml serumfreiem Medium auf, um eine 2 mM Standardlösung von AMP zu erhalten.
- Zur Herstellung von ADO wiegen Sie 0,00265 g ADO ab und lösen Sie es in 5 ml serumfreiem Medium auf, um eine 2 mM Standardlösung von ADO zu erhalten.
- Zur Herstellung von INO wiegen Sie 0,00268 g INO ab und lösen Sie es in 5 ml serumfreiem Medium auf, um eine 2 mM Standardlösung von INO zu erhalten.
- Bereiten Sie eine 400 μM Lösung aus AMP, ADO und INO vor, indem Sie 1 ml der 2 mM Stammlösung in 4 ml serumfreiem Medium (5 ml Endvolumen) mischen.
- Jede 400 μM Standardlösung wird 1:4 verdünnt, um eine Konzentration von 100 μM zu erhalten, indem 500 μl der 400 μM Lösung in 1.500 μl serumfreies Medium (2 ml Endvolumen) pipettiert werden.
- Bereiten Sie serielle Verdünnungen jeder Verbindung in serumfreiem Medium vor, um die folgenden Konzentrationen zu erhalten: 100 μM - 50 μM - 25 μM - 10 μM - 5 μM - 2,5 μM - 1 μM - 0,5 μM - 0,25 μM.
Hinweis: Pipettieren Sie z. B. 1 ml der 100 μM-Lösung in 1 ml serumfreies Medium (1:2-Verdünnung), um eine Konzentration von 50 μM zu erhalten, und fahren Sie mit den restlichen Verdünnungen fort.
- Es wird eine 10 mM alte Stammlösung aus in PBS gelöstem APCP hergestellt, aliquotiert und bei -30 °C bestückt.
- 10 mM Stammlösungen aus EHNA-Hydrochlorid, dCF und Dipyridamol, gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO), herstellen; aliquot und Stammstoff bei -30 °C.
2. Programmieren Sie die HPLC-Methode
- Bereiten Sie einen 7 mM Ammoniumacetatpuffer vor, indem 0,770 g Ammoniumacetat in 2 l doppelt deionisiertem Wasser (Puffer A) gelöst werden. Mit Salzsäure auf pH 3,0 einstellen.
- Bereiten Sie eine Glasflasche mit mindestens 2 l hochreinem Acetonitril für die HPLC vor (Puffer B) und schließen Sie die Vorsäule und die Säule an die HPLC an.
Hinweis: Die Spalten und Puffer befinden sich während der Verwendung auf RT.
- Loggen Sie sich in die HPLC-Software ein und wählen Sie die Schaltfläche "Projekt durchsuchen". Gehen Sie zum Menü "Datei" und wählen Sie "Neue Methode" und dann "Instrumentenmethode".
- Programmieren Sie die Methode der Äquilibrierungssäule gemäß Tabelle 1. Stellen Sie eine Durchflussrate von 1,00 ml/min ein und programmieren Sie den UV-Detektor so, dass er bei 260 nm ablestet. Speichern Sie die Instrumentenmethode und wählen Sie im Menü "Datei" erneut "Neue Methode" und dann "Methodenset". Wählen Sie die zuvor gespeicherte Instrumentenmethode aus und speichern Sie das aktuelle Methodenset mit demselben Namen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3, um die in Tabelle 2 angegebene Methode zum Ausführen von Stichproben zu programmieren. Stellen Sie eine Durchflussrate von 1,00 mL/min ein und programmieren Sie den UV-Detektor so, dass er bei 260 nm ablestet. Speichern Sie die Gerätemethode und wiederholen Sie die gleiche Prozedur wie in Schritt 4.4 beschrieben, um den Methodensatz zu speichern.
- Wählen Sie die Schaltfläche "Samples ausführen" und wählen Sie "Neue Sample-Set-Methode" aus dem Menü "Datei".
- Wählen Sie die Option "leer" und geben Sie die Nummer des Fläschchens (im Autosampler), den Probennamen und das Injektionsvolumen (50 μl) ein. Wählen Sie in der Spalte "Methodensatz" den zuvor gespeicherten Methodensatz aus und geben Sie die Gesamtlaufzeit (min) ein.
Hinweis: Geben Sie vor jedem Probenlauf in der Spalte "Methodensatz" die Methode der Äquilibrierungsspalte (Tabelle 1) ein und geben Sie die Gesamtlaufzeit (min) ein.
3. Erzeugung einer Standard-Kalibrierkurve für jede Verbindung
- Injizieren Sie 50 μl Blindprobe (spezifisches serumfreies Medium, das keine Adenosin-Desaminase enthält) und von jeder Standardprobe nach den in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschriebenen Methoden.
- Verwenden Sie die Äquilibrierungssäulenmethode (Tabelle 1) vor jedem Probenlauf und stellen Sie die in Tabelle 2 beschriebenen Gradientenbedingungen ein, um einen angemessenen Peakabstand zu erhalten. In Tabelle 3 finden Sie die angegebenen Retentionszeiten von AMP, ADO und INO unter diesen HPLC-Bedingungen.
- Bestimmen Sie die Peakfläche von AMP, ADO und INO bei unterschiedlichen Konzentrationen, indem Sie in der HPLC-Software auf die Schaltfläche "Prozess" und dann auf die Option "Integrieren" klicken. Alternativ können Sie den Start- und Endpunkt jedes Peaks manuell auswählen.
- Plotten Sie die Peakbereiche gegen die nominale Konzentration jedes Standards, um die Neun-Punkt-Kalibrierkurve (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 μM) zu erhalten.
- Berechnen Sie die Gleichung einer Geraden für AMP, ADO und INO: y = mx + b,
wobei x die μM-Konzentration und y der Peakfläche entspricht.
Uhr
kg
Uhr
kg
Uhr
Uhr
Uhr
| Zeit | Durchflussmenge (ml/min) | %A | %B |
| 1,00 | 100 | 0 |
| 1,24 | 1,00 | 100 | 0 |
| 6,22 | 1,00 | arabische Ziffer | 98 |
| 18.65 | 1,00 | arabische Ziffer | 98 |
Tabelle 1: Methode der Äquilibrierungssäule. Schematische Darstellung der Lösungsmitteländerungen für die Äquilibrierung der Säule. Puffer A: 7 mM Ammoniumacetat, pH 3,0. Puffer B: Acetonitril.
Uhr
kg
Uhr
kg
Uhr
Uhr
Uhr
Uhr
Uhr
| Zeit | Durchflussmenge (ml/min) | %A | %B |
| 1,00 | 0 | 100 |
| 3,74 | 1,00 | 0 | 100 |
| 13,71 | 1,00 | Nr. 15 | 85 |
| 17.00 | 1,00 | 100 | 0 |
| 20.00 | 1,00 | 100 | 0 |
Tabelle 2: Beispielmethode ausführen. Schematische Darstellung von Lösungsmittelveränderungen für die HPLC-Messung von Purinverbindungen. Puffer A: 7 mM Ammoniumacetat, pH 3,0. Puffer B: Acetonitril.
| Verweildauer | λmax |
| Ampere | 8.00 Minuten | 260 |
| Ino | 11.00 min | 260 |
| Getue | 11.90 Minuten | 260 |
Tabelle 3: Retentionszeiten von Purinverbindungen. Typische Retentionszeiten für AMP, ADO und INO. Der UV-Detektor ist so programmiert, dass er bei 260 nm liest.
4. Vorbehandlung mit den Inhibitoren und Inkubation mit dem Substrat (AMP)
- Um den AMP-Verbrauch, die ADO- und INO-Erzeugung ohne Hemmung von CD73-, ADA- und Nukleosidtransportern zu testen, resuspendieren Sie die gereinigten 2 x 106 CD19+/CD5+ CLL-Zellen in 250 μl serumfreiem Medium und Plattenzellen in einer 48-Well-Platte (oder in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen).
- 250 μl 400 μM AMP oder AMP plus Inhibitoren werden zugegeben, um eine Endkonzentration von 200 μM AMP zu erhalten. Es ist eine Bedingung anzugeben, in der das Substrat nicht als Blindprobe verwendet werden soll.
- 30 bis 60 min bei 37 °C inkubieren.
- Am Ende der Inkubationszeit 500 μl der Überstände in kalten Mikrozentrifugenröhrchen (auf Eis) auffangen und sofort bei 17.000 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren.
- Die Überstände werden in neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und sofort bei -80 °C gelagert oder mit der Probenvorbereitung für die HPLC-Läufe fortgefahren.
5. Probenvorbereitung für die HPLC
- Filtrieren Sie die Überstände in neuen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit den 0,2 μm Spritzenvorsatzfiltern. Verwenden Sie 1-ml-Spritzen zum Filtrieren.
- Wenn das HPLC-System mit einem Autosampler ausgestattet ist, bereiten Sie die Glasfläschchen für die HPLC vor und verwenden Sie die 0,1 ml Mikroeinsätze für kleine Probenmengen.
- Mindestens 100 μl der Probe mit einer Mikropipette oder einer Pasteur-Glaspipette in das Glasfläschchen überführen. Achten Sie darauf, dass die Durchstechflasche blasenfrei übertragen wird, und verschließen Sie das Fläschchen mit dem Schraubverschluss.
- Die Proben sind nun bereit für die Analyse mittels RP-HPLC.
6. HPLC-Messungen von Purinen
- Wählen Sie die Schaltfläche "Samples ausführen" und wählen Sie "Neue Sample-Set-Methode" aus dem Menü "Datei".
- Wählen Sie die Option "leer" und geben Sie Folgendes an: die Nummer des Fläschchens (im Autosampler), den Namen der Probe und das Injektionsvolumen (50 μl).
- Wählen Sie die in Tabelle 1 bzw. Tabelle 2 beschriebene Äquilibrierungsspaltenmethode und die in Tabelle 2 beschriebene Stichprobenmethode für alle folgenden Leerproben und Stichprobenläufe aus.
Anmerkung: Legen Sie die Methode der Äquilibrierungsspalten (Tabelle 1) vor jedem Stichprobenlauf fest.
- Injizieren Sie 50 μl Blindwert (serumfreies Medium) und von jeder Probe.
- Bestimmen Sie die Purinkonzentration in jeder Probe, quantifizieren Sie AMP, ADO und INO, indem Sie die Peakbereiche bei den in Tabelle 3 beschriebenen Retentionszeiten ermitteln.
- Wählen Sie die Schaltfläche "Verarbeiten" und dann die Option "Integrieren". Alternativ können Sie den Start- und Endpunkt jedes einzelnen Peaks manuell auswählen, um die Flächenmessung zu erhalten. Dies geschieht, indem eine Linie zwischen dem Start- und Endpunkt des Peaks gezogen wird.
- Die μM-Konzentration wird mit der Gleichung für die Standardkurve bestimmt: y = mx + b, wobei x die μM-Konzentration und y die Fläche des Peaks ist, die aus der unbekannten Probe gemessen wurde.
HINWEIS: Ein Beispiel für die ADO-Kalibrierstandardkurve ist in Abbildung 1 dargestellt, wobei: x = (y-Bereich - 981.02)/40026
- Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass 2 x 106 Zellen in 0,500 ml Medium resuspendiert wurden, berechnen Sie die μmol AMP, ADO und INO, die von 106 CLL-Zellen verbraucht und/oder produziert wurden, unter Anwendung des folgenden Verhältnisses:
μmol : 1.000 ml = x μmol : 0,250 ml
Anmerkung: Die μmol in 1.000 ml (Anzahl μmol in 1 L) entsprechen der μM-Konzentration und x sind die μmol des Nukleotids oder Nukleosids, die von 106 Zellen produziert werden. Zuletzt wandeln Sie die μmol in nmol um, die von 106 CLL-Zellen verbraucht und/oder produziert werden: nmol = μmol x 1.000
