Isolierung fluoreszenzmarkierter T-ALL-Zellen: Eine Methode zur Isolierung von T-ALL-Zellen aus adulten Zebrafischen

Zusammenfassung

Quelle: Pruitt, M. M., et al. Isolierung der Seitenpopulation bei Myc-induzierter akuter lymphatischer T-Zell-Leukämie im Zebrafisch. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Protokoll beschreibt die Technik, fluoreszenzmarkierte T-Zell-Tumorzellen der akuten lymphatischen Leukämie (T-ALL) aus einem erwachsenen Zebrafisch zu isolieren und sie mit Hilfe des Trypanblau-Farbstoffs zu quantifizieren.

Protokoll

>1. Entnahme von fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen aus dem primären Tumorfisch

1. Bereiten Sie mindestens 20 ml 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum in 0,9x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (FBS/PBS) vor.
2. Geben Sie 1 ml FBS/PBS in eine Durchstechflasche mit Heparin-Natriumsalz (300 Einheiten).
3. Wählen Sie Fische aus, die Tumore in mehr als 50 % des Körpers tragen, oder Fische, die Schwierigkeiten beim Fressen oder Schwimmen haben. Opfern Sie die Fische, indem Sie sie mit Tricain überdosieren oder in Eiswasser eintauchen. Bestätigen Sie den Tod durch Mangel an Kiemenbewegung und Herzschlag.
4. Verwende eine Rasierklinge, um den Kopf des Fisches zu entfernen.
5. Waschen Sie den Hohlraum des Fisches mit der Heparinlösung, um überschüssige rote Blutkörperchen zu entfernen.
   1. Injizieren Sie mit einer Pipette 100 μl Heparinlösung (1 ml FBS/PBS in eine Durchstechflasche mit Heparin-Natriumsalz) in die Körperhöhle des Fisches. Entfernen Sie alle austretende Flüssigkeit (sie enthält Blutzellen) und pipettieren Sie sie in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Verwenden Sie eine frische Pipettenspitze, um den Körper erneut zu waschen. Führen Sie mindestens drei Wäschen durch oder bis die austretende Flüssigkeit blutfrei erscheint.
   3. Entsorgen Sie in diesen Schritten die gesamte Flüssigkeit aus den Waschungen, da sie für weitere Analysen nicht verwendet wird.
6. Sammeln Sie die Leukämiezellen.
   1. Injizieren Sie 100 μl FBS/PBS in die Körperhöhle des Fisches.
   2. Üben Sie mit der Pipettenspitze sanften Druck auf die Außenseite des Körpers des Fisches aus, um die Tumorzellen herauszudrücken/herauszudrücken.
      Anmerkung: Wird dieser Schritt mit einem Präpariermikroskop durchgeführt, sind die Tumorzellen sichtbar, die aus der Körperhöhle austreten.
   3. Sammeln Sie die Flüssigkeit und die Zellen aus jedem Waschgang in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.6.1-1.6.3, bis die meisten Tumorzellen entnommen sind (in der Regel 5-10 Mal). Sammeln Sie alle Tumorzellen in demselben 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf.
7. Mischen Sie die gesammelten Tumorzellen aus dem vorherigen Schritt, indem Sie sie vorsichtig pipettieren, um die Zellklumpen zu dissoziieren. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 40-μm-Maschenfilter. Waschen Sie den Filter 1-2 Mal mit 100 μL FBS/PBS. Bewahren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf.
8. Mischen Sie 2 μl Zellsuspension mit 18 μl Trypanblau (0,4 %, 1:10 verdünnt und filtriert) in einem neuen Röhrchen. Laden Sie 10 μl auf ein Hämozytometer und zählen Sie die Anzahl der lebenden (nicht blauen) fluoreszierenden Zellen, um die Anzahl der isolierten Tumorzellen zu berechnen.
   Anmerkung: Nicht-blaue GFP-negative Zellen sind wahrscheinlich normale, nicht-maligne T-Zellen und sollten nicht gezählt werden. Mindestens 2 x 10⁶ Zellen werden benötigt, um die Zellen mit Hoechst 33342 zu färben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Syngener Zebrafisch (CG2)			Siehe Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc-Plasmid			Labor Langenau
rag2:GFP-Plasmid im de Jong Lab konstruiert			rag2-Promotor aus dem Labor Langenau
pCS2-Transposase-Plasmid			Labor Chien
SteREO Discovery V8 Mikroskop	Carl Zeiss Mikroskopie	Artikel-Nr.: 495015-0008-000
Tricain-Methansulfonat (MS-222)	Western Chemical, Inc	Fisher Scientific - NC0342409	ca. 100 g
Fötales Rinderserum (FBS)	HyClone Laboratories, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco von Life Technologies	Nr. 1001-023	pH-Wert 7,4 (1x) - 500 mL
Heparin-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	Nr. 2106	Fläschchen mit 15 - 300 Einheiten
40 μm Maschenfilter	Marke Falcon Corning	Artikel-Nr.: 352340	Kiste mit 50 Stück
Trypan-Blau	Sigma Lebenswissenschaften	Nr. T8154	20 mL - Lösung (0,4%)