$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Färben der fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen mit Hoechst 33342 zur Identifizierung der Seitenpopulation
- Hoechst 33342 1:10 mit nukleasefreiem H2O verdünnen, um die Arbeitskonzentration von 1 mg/ml zu erreichen. Lagern Sie den Farbstoff bei 4 °C und im Dunkeln.
- Bereiten Sie eine 100-mM-Lösung von Verapamil her, indem Sie 49,1 mg in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) lösen.
Anmerkung: Verapamil ist ein Inhibitor von ABC-Transportern und eine wichtige Kontrolle für Nebenpopulationsexperimente. Die Zugabe von Verapamil zu Proben hemmt die Fähigkeit der ABC-Transporter, den Farbstoff Hoechst 33342 auszueffluxieren. Daher verschwindet eine echte Nebenpopulation, wenn der Probe Verapamil zugesetzt wird.
- Stellen Sie ein Wasserbad auf 28 °C ein.
- Bereiten Sie Proben und Kontrollen im Dunkeln vor, indem Sie Zellen und Lösungen in Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierer-Röhrchen (FACS) geben.
- Bereiten Sie die Proben vor, indem Sie 106 Zellen, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 und 2,5 μl DMSO in ein FACS-Röhrchen geben. Stellen Sie das Volumen mit FBS/PBS auf 1 mL ein.
- Bereiten Sie die Kontrollen vor, indem Sie 106 Zellen, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 und 2,5 μl 100 mM Verapamil in ein FACS-Röhrchen geben. Stellen Sie das Volumen mit FBS/PBS.
auf 1 mL ein
Anmerkung: Es wird eine Mindestmenge von 10bis 6 Zellen/Probe empfohlen, aber es wird bevorzugt, mehr Zellen zu färben, insbesondere wenn die Zellen der Seitenpopulation für die weitere Analyse sortiert werden. Überschreiten Sie nicht 106 Zellen/ml und halten Sie die Hoechst 33342-Konzentration bei 15 μg/ml. Wenn 10 x 106 Zellen gefärbt werden, beträgt das Gesamtreaktionsvolumen 10 mL.
In - einem 28 °C warmen Wasserbad im Dunkeln 120 min inkubieren.
- Legen Sie die Zellen nach der Inkubation sofort auf Eis und bewahren Sie sie im Dunkeln auf.
- Die Zellen werden bei 4 °C für 6 min bei 300 x g pelletiert. Den Überstand entfernen. Mit 1 mL FBS/PBS waschen.
- Die Zellen werden bei 4 °C für 6 min bei 300 x g pelletiert. Den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml FBS/PBS.
- Bis zur Zellsortierung bei 4 °C aufbewahren.
- 15 Minuten vor der Zellsortierung 2 μl Propidiumiodid (PI)-Stamm (1 mg/ml) zu je 1 ml FBS/PBS (Endkonzentration: 2 μg/ml) hinzufügen. Gut mischen.
2. Verwenden Sie FACS, um die Seitenpopulation innerhalb der fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellpopulation zu finden
- Analysieren Sie die gefärbten Zebrafisch-T-ALL-Zellsuspensionen auf einem Zellsortierer, der mit einem UV-Laser für die Farbstoffanregung Hoechst 33342 und einem 488-nm-Laser für die PI-Anregung und für die Detektion der GFP+ T-ALL-Zellen ausgestattet ist.