Side Population Assay: Eine Methode zur Isolierung der Seitenpopulation von Tumorzellen aus Zebrafischen

Zusammenfassung

Quelle: Pruitt, M. M., et al. Isolierung der Seitenpopulation bei Myc-induzierter akuter lymphatischer T-Zell-Leukämie im Zebrafisch. J. Vis. Exp. (2017).

Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung der Seitenpopulation von T-Zell-Tumorzellen der akuten lymphatischen Leukämie (T-ALL), bestehend aus Stammzellen, aus einem adulten Zebrafisch. Der Seitenpopulation fehlen markante Zellmarker, daher verwenden wir den Hoechst 33342 Farbstoff-Efflux-Assay, um sie zu isolieren.

Protokoll

1. Färben der fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen mit Hoechst 33342 zur Identifizierung der Seitenpopulation

1. Hoechst 33342 1:10 mit nukleasefreiem H₂O verdünnen, um die Arbeitskonzentration von 1 mg/ml zu erreichen. Lagern Sie den Farbstoff bei 4 °C und im Dunkeln.
2. Bereiten Sie eine 100-mM-Lösung von Verapamil her, indem Sie 49,1 mg in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) lösen.
   Anmerkung: Verapamil ist ein Inhibitor von ABC-Transportern und eine wichtige Kontrolle für Nebenpopulationsexperimente. Die Zugabe von Verapamil zu Proben hemmt die Fähigkeit der ABC-Transporter, den Farbstoff Hoechst 33342 auszueffluxieren. Daher verschwindet eine echte Nebenpopulation, wenn der Probe Verapamil zugesetzt wird.
3. Stellen Sie ein Wasserbad auf 28 °C ein.
4. Bereiten Sie Proben und Kontrollen im Dunkeln vor, indem Sie Zellen und Lösungen in Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierer-Röhrchen (FACS) geben.
   1. Bereiten Sie die Proben vor, indem Sie 10⁶ Zellen, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 und 2,5 μl DMSO in ein FACS-Röhrchen geben. Stellen Sie das Volumen mit FBS/PBS auf 1 mL ein.
   2. Bereiten Sie die Kontrollen vor, indem Sie 10⁶ Zellen, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 und 2,5 μl 100 mM Verapamil in ein FACS-Röhrchen geben. Stellen Sie das Volumen mit FBS/PBS.
      auf 1 mL ein Anmerkung: Es wird eine Mindestmenge von 10^{bis 6} Zellen/Probe empfohlen, aber es wird bevorzugt, mehr Zellen zu färben, insbesondere wenn die Zellen der Seitenpopulation für die weitere Analyse sortiert werden. Überschreiten Sie nicht 10⁶ Zellen/ml und halten Sie die Hoechst 33342-Konzentration bei 15 μg/ml. Wenn 10 x 10⁶ Zellen gefärbt werden, beträgt das Gesamtreaktionsvolumen 10 mL.
In
5. einem 28 °C warmen Wasserbad im Dunkeln 120 min inkubieren.
6. Legen Sie die Zellen nach der Inkubation sofort auf Eis und bewahren Sie sie im Dunkeln auf.
7. Die Zellen werden bei 4 °C für 6 min bei 300 x g pelletiert. Den Überstand entfernen. Mit 1 mL FBS/PBS waschen.
8. Die Zellen werden bei 4 °C für 6 min bei 300 x g pelletiert. Den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml FBS/PBS.
9. Bis zur Zellsortierung bei 4 °C aufbewahren.
10. 15 Minuten vor der Zellsortierung 2 μl Propidiumiodid (PI)-Stamm (1 mg/ml) zu je 1 ml FBS/PBS (Endkonzentration: 2 μg/ml) hinzufügen. Gut mischen.

2. Verwenden Sie FACS, um die Seitenpopulation innerhalb der fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellpopulation zu finden

1. Analysieren Sie die gefärbten Zebrafisch-T-ALL-Zellsuspensionen auf einem Zellsortierer, der mit einem UV-Laser für die Farbstoffanregung Hoechst 33342 und einem 488-nm-Laser für die PI-Anregung und für die Detektion der GFP+ T-ALL-Zellen ausgestattet ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fötales Rinderserum (FBS)	HyClone Laboratories, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco von Life Technologies	Nr. 1001-023	pH-Wert 7,4 (1x) - 500 mL
Hoechst 33342	Lebenstechnologien	Nr. H3570	10 mL
Verapamil	Sigma Lebenswissenschaften	Nr. V4629	1 g
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma Lebenswissenschaften	Nr. D8418	100 mL
Propidiumiodid	Lebenstechnologien	Nr. P3566	10 mL
FACSAria Fusion Zellsortierer	BD Biowissenschaften