In-vitro-Assay zur Pankreas-Neuroplastizität: Untersuchung von Veränderungen in Neuronen des Magen-Darm-Trakts, die gesunden und krebsartigen menschlichen Pankreasgewebeextrakten ausgesetzt waren

Zusammenfassung

Quelle: Demir, I. E., et al. Simulation der Pankreas-Neuroplastizität: In-vitro-Dual-Neuron-Plastizitätstest. J. Vis. Exp. (2014).

Dieses Video zeigt in vitro einen Neuroplastizitätsassay, um die morphologischen Veränderungen in den Spinalganglien und Myenterusplexus-Neuronen zu untersuchen, die gesunden und krebsartigen menschlichen Pankreasgewebeextrakten ausgesetzt waren. Dieser Assay ermöglicht es uns, das Wachstum von Neuriten, das Verzweigungsmuster und die Größe der Neuronen zu untersuchen.

Protokoll

>1. Isolierung von Neuronen

Sobald die Extrakt-/Überstandssammlung abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Isolierung der Neuronen fort.

1. Für DRG-Neuronen sammeln Sie das zervikale bis lumbale DRG von neugeborenen Ratten zwischen dem postnatalen Tag (P) 2-12 nach der Enthauptung und der stereomikroskopischen Dissektion von DRG (Abbildung 1A). Um genügend DRG-Neuronen für eine 24-Well-Platte zu haben, sammeln Sie alle zervikalen bis lumbalen DRG einer neugeborenen Ratte (entspricht 52 DRG) pro Platte.
2. Die peripheren (neuralen) und zentralen Vorsprünge (Wurzeln) der DRG werden mit einer Mikroschere abgeschnitten. Wenn die Projektionen an Ort und Stelle bleiben, wird die Verreibung behindert und das Kontaminationsrisiko der Kultur durch Fibroblasten erhöht.
3. Bei MP-Neuronen schneiden Sie das Mesenterium vom Dünndarm ab und entfernen Sie manuell und vorsichtig die seromuskuläre Schicht des Dünndarms (für ein detailliertes Protokoll zur MP-Isolierung siehe Abbildung 1B). Für MP sammeln Sie den Plexus von zwei Ratten pro 24-Well-Platte.
   Anmerkung: Versuchen Sie, so sanft wie möglich zu sein, um Risse in der seromuskulären Schicht zu vermeiden, da sie die erfolgreiche Trennung vom Dünndarm behindern.
4. Sammeln Sie das DRG und die seromuskuläre Schicht in eiskaltem minimal essentiellem Medium (MEM), das mit Gentamicin (20 mg in 500 ml Medium) und Metronidazol (2,5 mg in 500 ml Medium) versorgt wird.
5. Nach der Entnahme von DRG inkubieren Sie sie 20-30 Minuten lang in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), die mit Kollagenase Typ II geliefert wird. Für die MP-Isolierung inkubieren Sie je nach Alter des Tieres zwischen 1 und 3 Stunden im Kollagenase-Typ (Abbildung 1C).
6. Für MP sammeln Sie die netzartigen MP-Stücke unter einem Stereomikroskop und übertragen sie auf eiskaltes MEM.
7. Zerreiben Sie dann DRG und MP durch Spritzen mit abnehmendem Durchmesser.
   Anmerkung: Übermäßige Verreibung kann die Neuronen zerstören, aber weniger die Gliazellen.
8. Sobald das Medium, das das DRG oder MP enthält, trüb geworden ist, zentrifugieren Sie die Suspension bei 93,9 x g für 5 min, verwerfen Sie das Medium und resuspendieren Sie es in Neurobasalmedium (ergänzt mit 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 2 % B-27).
9. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen (d.h. Neuronen UND Glia) mit Hilfe eines Hämozytometers.
   Anmerkung: Die Anzahl der benötigten Zellen ist abhängig vom Messparameter. Für die Quantifizierung der Neuritendichte benötigt man dichtere Kulturen und damit eine größere Anzahl von Zellen als für die Messung des Neuritenwachstums, der perikaryonalen Größe und des Verzweigungsmusters einzelner Neuronen. Für die Messung der Neuritendichte verwenden Sie z.B. 10.000 Zellen (Neuron+Glia)/Vertiefung oder 1.500 Neuronen/Vertiefung. Für die Morphometrie an einzelnen Neuronen wird eine kurze (1 Minute lange) Trypsinisierung der Zellen und Aussaat von 2.500 Zellen/Vertiefung oder 400 Neuronen/Vertiefung empfohlen. Die typische Ausbeute an Zellen aus einer Ratte liegt bei etwa 300.000 bis 500.000 Zellen.
10. Die Zellen werden auf 13 mm Deckgläser ausgesät, die am Vorabend beschichtet wurden, und die Vertiefungen mit Neurobasalmedium (ergänzt mit 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 2 % B-27) verschließen (Abbildung 1D).
    Anmerkung: Verwenden Sie mit Poly-D-Lysin (40 mg/^{m 2}) ODER Ornithin- und Laminin-beschichtete (je 1 mg/ml) beschichtete Deckgläser. Zellen heften sich extrem schnell an Poly-D-Lysin und eignen sich daher für Experimente, bei denen viele Zellen benötigt werden (z.B. Neuritendichtemessungen). Die Bindung an Laminin ist im Allgemeinen etwas schwächer, aber Laminin ist ein starker Förderer des Neuritenwachstums. Daher ist für Messungen der neuronalen Verzweigung und der Neuritenlänge die Ornithin/Laminin-Beschichtung zu bevorzugen.
11. Lassen Sie die Zellen über Nacht an den Vertiefungen haften. Bereiten Sie am nächsten Tag das mit Extrakt ergänzte Medium vor (bei einer endgültigen Extrakt-/Überstandskonzentration von 100 μg/ml).
12. Aspirieren Sie das Aussaatmedium, führen Sie eine optionale, sehr schonende Reinigung mit PBS durch und pipettieren Sie dann langsam das Extrakt-/Überstandsmedium (Abbildung 1E).
13. Lassen Sie die Zellen 48 Stunden lang wachsen. Aspirieren Sie das Medium und fixieren Sie es mit 4 % Paraformaldehyd für die Immunfärbung (Abbildung 1F).
14. Führen Sie eine doppelte Immunfluoreszenzfärbung mit neuronenspezifischen (z. B. Beta-III-Tubulin) und gliaspezifischen (z. B. saures Gliafibrillenprotein/GFAP) Markern durch (Abbildung 1G).
15. Für die Morphometrie ist ein inverses Lichtmikroskop zu verwenden, das mit einer CCD-Kamera in Kombination mit einer automatisierten Software ausgestattet ist, die die Messung der Neuritendichte ermöglicht (siehe Tabelle).
16. Die Neuritendichte von neuronalen Kulturen wird auf 4-5 repräsentativen Mikroaufnahmen bei 200-facher Vergrößerung aus 4 verschiedenen Regionen mit dem dichtesten Wachstum auf jedem Deckglas gemessen, indem ein 50 μm x 50 μm großes Gitter überlagert und die Faserdichte pro Quadrat gezählt wird, gemessen in den sich schneidenden Fasern. Das Neuritauswachstum, die mittlere Anzahl der Äste pro Neuron, die mittlere Astlänge und die perikaryonale Größe können anhand von zufällig ausgewählten 30 solitären Neuronen aus jedem Deckglas gemessen werden, indem die Neuriten und die Perikarya markiert werden (Abbildung 1H).

Ergebnisse

Abbildung 1. Schematisches Protokoll des in vitro Neuroplastizitätsassays. Der vorliegende Assay verwendet neugeborene Spinalwurzelganglien (DRG) und Neuronen des Myenterusplexus (MP) von Ratten, um den Einfluss von Pankreasgewebeextrakten oder Zellüberständen auf die neuronale und gliale Morphologie zu untersuchen. DRG werden nach anteriorer Laminektomie und MP-haltige ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Poly-D-Lysin-Hydrobromid	Sigma-Aldrich	Nr. P1149
Ornithin/Laminin	Sigma-Aldrich	Nr. P2533/L4544
13 mm Deckgläser	Merck		Für den Einsatz in 24-Well-Platten
Membranator S	Schneidermuskel
Anti-Beta-III-Tubulin-Antikörper	Millipore	MAB1637	1:200 Konzentration
Anti-GFAP-Antikörper	DAKO	Nr. M0761	1:400 Konzentration
RIPA-Puffer + Proteaseinhibitor			Jeder Lieferant
Neurobasales Medium	Gibco/Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 21103-049
B-27 Zuschlag	Gibco/Biowissenschaften	17504044	Es ist bekannt, dass die Qualität von B-27 von der Chargennummer abhängt
Gentamicin/Metronidazo			Jeder Lieferant
Minimales essentielles Medium	Gibco/Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 31095-029
Hank's Ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Gibco/Biowissenschaften	24020133	Verbessert die Kollagenase-Aktivität bei Gehalt an Ca/Mg
Kollagenase Typ II	Worthington Biochemie	CLS-2	Partien mit einer Aktivität von mindestens 200 U/mg erhalten
Trypsin-EDTA 0,25 %	Gibco/Biowissenschaften	25200056
4% Paraformaldehyd			Jeder Lieferant
AnalySIS Doku-Software	Olymp