>1. Vorbereitung der Zellkultur und Versuchsaufbau
- Bewahren Sie humane Darmkrebszellen, HCT-116, wie vom Lieferanten empfohlen, in Monolayern in 75 cm2 Kulturflaschen auf, die 10 ml des formulierten McCoy's 5a Medium Modified enthalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % antibiotischer antimykotischer Lösung.
- Züchten Sie die Zellen in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % CO2 bei 37 °C bis 70 % Konfluenz mit einer Erneuerung des Mediums alle 2 bis 3 Tage.
- Um den BNCT-Strahl (z. B. Neutronenstrahl plus BPA) und den BNCT-Effekt der Abtötung von Krebszellen als schwere Teilchen zu erzielen und den größten Teil ihrer Energie in den borhaltigen Krebszellen zu deponieren, fügen Sie am Tag vor der Bestrahlung dem Zellkulturmedium ein Bor-Trägermittel hinzu – z. B. 10BPA, 4-Borono-L-phenylalanin (10 μg 10B/ml, 0,925 mM endgültig) 12–16 h (maximale Aufnahme von Bor) vor der Bestrahlung.
Anmerkung: Wenn Sie eine andere Zelllinie verwenden, für die im Falle einer BNCT-Studie keine Daten vorliegen, testen Sie die Boraufnahme für jede Zelllinie, um die optimale Borkonzentration zu erhalten. Messung der zellulären BPA-Aufnahme durch optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES), wie sie von der Dagrosa-Gruppe durchgeführt wird.
- Nach 12-16 h Borabgabe aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 10 mL 1x PBS. Trypsinisieren Sie dann die Zellen, indem Sie den Zellen 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung zusetzen und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, um die Zellablösung zu verbessern. Wenn sich die Zellen abzulösen beginnen, stoppen Sie die Trypsinwirkung, indem Sie 10 ml vollständiges Medium hinzufügen.
- Aspirieren Sie die Zellsuspension im 15-ml-Röhrchen und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler, indem Sie 10 μl 0,4 % Trypanblau zu 10 μl Zellen hinzufügen, mischen und aliquotieren Sie 10 μl auf einem Zählobjektträger. Die Zellsuspension wird auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml des Mediums verdünnt. Aliquot 1 ml der Zellsuspension pro Kryoröhrchen.
- Bereiten Sie Thermolumineszenzdosimeter (TLDs) für die Messung von Gammastrahlendosen und Goldfolien für die Neutronenfluenzen vor und befestigen Sie TLDs vor der Bestrahlung an den Kryoröhren oder Zellkulturkolben.
- Bestrahlen Sie die 1 x 106 Zellen/ml mit dem neutronengemischten Strahl bei einem empfohlenen minimalen thermischen Neutronenfluss von 5,9 x 1011 (n/cm-2 min-1)4 in Kulturflaschen oder Kryoröhrchen, je nach den Fähigkeiten der Anlage.
Anmerkung: Stellen Sie die Zeit der Bestrahlung vorher ein, um den empfohlenen Neutronenfluss zu erhalten.
- Nach der Bestrahlung 1 ml bestrahlte Zellen (1 x 106 Zellen/ml) auf 22 x 22 mm Deckgläsern in 35 mm Petrischalen oder 6-Well-Platten aussäen, mit 2 mL des erforderlichen Mediums ergänzen. Die Zellen werden maximal 3 Stunden lang bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % CO2 inkubiert, damit sie an den Deckgläsern haften können. Beobachten Sie von Zeit zu Zeit die Anheftung von Zellen unter einem inversen Mikroskop mit 20x Objektiv.
Anmerkung: Für HCT-116-Zellen beträgt die Mindestdichte 600.000 Zellen bis zur Aussaat. Für eine schnelle weitere Färbung verwenden Sie Kammer-Objektträger, reduzieren Sie die Zelldichte entsprechend.
>2. Fixierung von Zellen
- Entfernen Sie nach der Bestrahlung und Inkubation der Zellen das Medium von den angehängten Zellen und waschen Sie die Zellen einmal mit 2,5 mL PBS.
- Fixieren Sie die Zellen mit 1 mL 70% Ethanol für 10 min bei RT.
Anmerkung: Alternativ können Sie 1%-3,7% Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung verwenden, wie zuvor empfohlen. Das Protokoll wird hier pausiert. Lagern Sie fixierte Zellen in Ethanol in einem Gefrierschrank bei -20 °C nicht länger als ein paar Wochen für weitere Analysen und Immunfluoreszenzfärbungen.
>3. Permeabilisierung von Zellen
- Nach der Fixierung das Ethanol aus der Petrischale entfernen und mit 2,5 mL 1x PBS.
Anmerkung: Lassen Sie die Zellen zwischen den Spülschritten nicht trocknen.
- Geben Sie vorsichtig 1 ml 0,2 % Triton X-100/PBS hinzu, um die Deckgläser mit Zellen in Petrischalen zu bedecken.
- 5 min bei RT inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit 2,5 mL von 1x PBS.
Anmerkung: Erhöhen Sie den Anteil von Triton X-100 in PBS bei Bedarf auf bis zu 0,5 % (mehr Herde nachweisbar, abhängig von der getesteten Zelllinie). Führen Sie zusätzliche Waschgänge mit PBST (PBS mit 0,5 % Tween) durch, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden.
- Blockieren Sie den Permeabilisierungsschritt mit 1 ml 2 % BSA (Bovine Serum Fraction V Albumin), verdünnt in PBS, und inkubieren Sie mindestens 30 min oder 1 h lang mit 1 % BSA.
Anmerkung: Dieser Schritt kann entfallen und ist abhängig von der Art des verwendeten Antikörpers. Alternativ können Sie wie empfohlen 5% FBS verwenden.
>4. Immunfluoreszenz-Färbung
- Geben Sie die richtige Menge an Primärantikörpern (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs und Anti-Rad52) in PBS verdünnt mit BSA (2 % Rinderserumfraktion V-Albumin) wie empfohlen hinzu (siehe Tabelle 1 mit empfohlenen Verdünnungen) (100 μl werden pro Probe benötigt).
kg
kg
kg
| Primärer Antikörper | Funktion | Empfohlene Verdünnung | Lagerung [°C] |
| Anti-ɣ-H2AX | Nachweis von DNA-DSBs | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-PKcs | Nachweis von RIFs des DNA-PKcs-Proteins, das zu NHEJ gehört | 1:200 Uhr (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | Detektion von RIFs des Rad52-Proteins, das zu HRR gehört | 1:200 Uhr (PBS-BSA) | -20 |
| Sekundärer Antikörper | | Im Dunkel | |
| Anti-Maus-IgG FITC | ɣ-H2AX-Brennpunkte | 1:400 Uhr (PBS-BSA) | 4 |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG H&L (Alexa Fluor 488) | für NHEJ- und HRR-Reparaturprotein-Herde | 1:500 Uhr (PBS-BSA) | -20 |
Tabelle 1: Empfohlene Verdünnungen und Hinweise für die Verwendung der in Abschnitt
- Decken Sie die Petrischale ab, um die Feuchtigkeit in einer Plastikbox mit befeuchtetem Lignin unter Verwendung von destilliertem Wasser zu halten, und inkubieren Sie sie 30 min bei 37 °C im Inkubator.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die Inkubation kann bei 4 °C über Nacht durchgeführt werden.
- Führen Sie nach der Inkubation 3 Waschgänge mit 2,5 ml PBS.
durch
Anmerkung: Lassen Sie den Objektträger während der Spülschritte nicht trocknen.
- Fügen Sie die richtige Menge an Sekundärantikörpern (Anti-Maus-IgG FITC, Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Alexa Fluor 488) hinzu, verdünnt in PBS mit BSA (siehe Tabelle 1) (100 μl werden pro Probe benötigt). Arbeiten Sie für diesen und die folgenden Schritte im Dunkeln.
- Decken Sie die Petrischale wieder ab, um die Feuchtigkeit in einer Plastikbox mit befeuchtetem Lignin zu halten, und inkubieren Sie sie mindestens 30 min bei 37 °C im Inkubator.
- Führen Sie nach der Inkubation 3 Wäschen mit 2,5 ml PBS durch.
- Geben Sie 100 μl DAPI in PBS verdünnt bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml, um die Zellkerne gegenzufärben.
- Kurz für maximal 2 min bei RT inkubieren.
- Führen Sie nach der Inkubation 3 Wäschen mit 2,5 ml PBS durch.
- Entfernen Sie das PBS und legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Oberseite des Eindeckmediums, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, und versiegeln Sie die Kanten des Deckglases mit Nagellack. Warten Sie, bis der Lack getrocknet ist, und malen Sie das Deckglas rundherum.
- Warten Sie die Aushärtung des Eindeckmediums ab (bis zu 3 h), bevor Sie die Bildanalyse unter Fluoreszenzmikroskopie durchführen.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Lagern Sie Objektträger in einer Kunststoffbox bei 4 °C im Dunkeln.
