>1. Zell-Seeding
- Säen Sie 2 x 105 HCT116-Darmkrebszellen pro Well in einer 24-Well-Platte aus und halten Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM).
- Ersetzen Sie das Nährmedium durch oder ohne 100 μM Eisensulfat (FS) oder 10 μM Doxorubicin (DOX), das Medium enthält, und inkubieren Sie es 24 Stunden lang.
>2. Vorbereitung der DCFH-DA-Lösung
- 4,85 mg DCFH-DA werden in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine 10 mM Stammlösung herzustellen.
- Verdünnen Sie die Stammlösung mit vorgewärmtem DMEM zu einer 10 μM Arbeitslösung, bevor Sie sie in die Vertiefungen geben.
- Vortex die Arbeitslösung für 10 s.
>3. DCFH-DA-Färbung
- Entfernen Sie das arzneimittelhaltige Medium und waschen Sie es einmal mit DMEM.
- Geben Sie 500 μl der DCFH-DA-Arbeitslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
- Entfernen Sie die funktionierende Lösung DCFH-DA. Einmal mit DMEM und 2x mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
- Geben Sie 500 μl 1x PBS in jede Vertiefung
.
>4. Bildaufnahme und Intensitätsmessung
- Nehmen Sie repräsentative Fluoreszenzbilder für jede Vertiefung mit dem grün fluoreszierenden Proteinkanal (GFP) an einem Fluoreszenzmikroskop auf.
- Entfernen Sie nach der Aufnahme von Bildern PBS und geben Sie 200 μl Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Puffer in jede Vertiefung
.
- 5 Minuten auf Eis inkubieren und dann das Zelllysat in 1,5-ml-Röhrchen sammeln.
- Zentrifugieren Sie bei 21.130 x g für 10 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie 100 μl des Überstands auf eine schwarze 96-Well-Platte und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm.
- 1 μl des Überstands wird auf eine durchsichtige 96-Well-Platte mit 100 μl 1x Protein-Assay-Lösung übertragen, um die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay zu messen.
- Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität mit den Proteinkonzentrationen.