Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Zelllinien kultivieren
- Züchten Sie HK-Zellen in vollständigem RPMI-1640-Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 nM Glutamin, 100 μμl Penicillin G und 100 mg/ml Streptomycin bei 37 °C in einem 5 % CO2 -befeuchteten Inkubator ergänzt wird.
Anmerkung: HK-Zellen sind normale humane follikuläre dendritische Zellen und können in vitro für ≤ 15 Passagen gezüchtet und expandiert werden.
2. Markierung und Anreicherung von Luciferase-markierten Tumoren
- Implantieren Sie Tumore direkt in die linke und rechte Flanke von 6-8 Wochen alten weiblichen NOD/SCID-Mäusen.
- Messen Sie das Tumorwachstum alle zwei Wochen mit einem digitalen Messschieber.
- Transduzieren Sie den Tumor bei einem Durchmesser von 1 cm. Injizieren Sie direkt eine Einzeldosis Luc/rot fluoreszierendes Protein (RFP)-Lentivirus (50 μl/Tumor, 1:30 Verdünnung aus konzentriertem Lentivirus-Bestand mit hohem Titer) in den Tumor unter Verwendung einer 1-cm³-Spritze mit einer 27-G-Nadel.
Anmerkung: Der Tumor des Patienten erreicht in der Regel innerhalb von 1-2 Monaten einen Durchmesser von 1 cm. Die Wachstumsrate ist jedoch äußerst variabel und basiert auf einer Reihe von Faktoren, einschließlich des Tumorgrades und der Art des Tumors.
>3. CRC-Mausmodell
- Betäuben Sie eine sechs bis acht Wochen alte männliche NOD/SCID-Maus mit Isofluran (2,5 % in 100 % Sauerstoff, 1 l/min) in der Induktionskammer. Bestätigen Sie die Sedierung mit einer Zehenkneife.
- Legen Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage unter ein Präpariermikroskop und achten Sie darauf, dass ihre Schnauze an einem Isofluran-Nasenkegel und ihre vorderen Gliedmaßen mit Klebeband befestigt sind, um die Stabilität zu gewährleisten.
Anmerkung: Lupen können anstelle eines Präpariermikroskops verwendet werden. Ein kleiner Gegenstand kann verwendet werden, um die Sichtbarkeit und den Winkel zu verbessern, wenn er unter der Basis des Schwanzes platziert wird, wodurch der Anus angehoben wird. Typischerweise werden kleine Gazeabschnitte in eine Zylinderform von 1 Zoll Durchmesser gewalzt.
- Erweitern Sie den Analkanal mit einer gebogenen, geschmierten, stumpfen Pinzette, um die distale Anal- und Rektumschleimhaut freizulegen. Fäkalien entfernen.
- Verwenden Sie eine sterile abnehmbare 30-G-Nadel auf einer 50-μl-Glasspritze, um 10 μl Luciferase-markierte Tumorzellen und HK-Zellen (10 μl Tumorzellen pro Maus für das CRC-Modell in vollständigen RPMI-Medien zu resuspendieren) in die distale posteriore rektale Submukosa, 1 bis 2 mm über dem Analkanal, zu injizieren. Die Fase der Nadel sollte von Schleimhaut bedeckt sein. Achten Sie darauf, nicht in die Beckenhöhle zu gelangen.
- Entfernen Sie die Maus aus dem Isofluran-Nasenkonus. Beobachten Sie es 1 Stunde lang nach dem Eingriff. Achte auf Anzeichen von Stress, z.B. gebeugter Rücken, mühsames Atmen usw.
4. Biolumineszierende Bildgebung
- Überwachen Sie wöchentlich die Metastasierungslast des Primärtumors, der Leber und der Lunge mit einem biolumineszierenden Bildgebungssystem auf Luciferase-Aktivität.
- Besorgen Sie sich ein Maus-CRC-Experiment und wiegen Sie es. Injizieren Sie 150 mg/kg Luciferin intraperitoneal und warten Sie 5 Minuten, bis das Substrat im Körper der Maus zirkuliert.
- Betäuben Sie die Maus mit 2,5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff, 1 L/min in der Induktionskammer.
- Platzieren Sie die Maus in einem BLI-Bildgebungsgerät, wobei die Nase im Nasenkonus fixiert ist. Achten Sie bei der Belichtung für ein Bild darauf, dass der Interessenbereich zur Kamera zeigt. Bei der Darmkrebsinjektion sollte die ventrale Seite für jedes Bild der Kamera zugewandt sein. Stellen Sie sich die Maus in Rückenlage vor.
