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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Die Vorbereitung von huA33-TCO
HINWEIS: Die Synthese von huA33-TCO wurde bereits berichtet. Zur Erleichterung des Lesers wird es hier jedoch mit Anpassungen für optimale Bedingungen repliziert.
- Bereiten Sie in einem 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eine 125-μl-Lösung von (E)-cyclooct-4-enyl-2,5-dioxo-1-pyrrolidinylcarbonat (TCO-NHS) in trockenem Dimethylformamid (DMF) in einer Konzentration von 40 mg/ml (0,15 M) vor. Diese Lösung kann aliquotiert und bei -80 °C eingefroren werden, um sie in zukünftigen Experimenten zu verwenden.
- Bereiten Sie in einem separaten 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eine 5 mg/ml-Lösung von huA33 in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 2,7 mM Kaliumchlorid, 137 mM Natriumchlorid und 11,9 mM Kaliumphosphat, pH 7,4) vor.
- Unter Verwendung kleiner Aliquots (<5 μl) von 0,1 M Na2CO3 wird der pH-Wert der Antikörperlösung von Schritt 1,2 auf 8,8-9,0 eingestellt. Verwenden Sie entweder pH-Papier oder ein pH-Messgerät mit einer Mikroelektrode, um den pH-Wert zu überwachen, und achten Sie darauf, dass der pH-Wert 9,0 nicht überschreitet.
- Zu der in Schritt 1.3 beschriebenen Antikörperlösung wird langsam ein Volumen hinzugefügt, das 40 molaren Äquivalenten von TCO-NHS im Verhältnis zur Antikörpermenge entspricht. Wenn sich beispielsweise 5 mg (30 nmol) huA33 in der Lösung befinden, fügen Sie 9,0 μl (1,20 μmol) der 40 mg/ml (0,15 m) Lösung von TCO-NHS.
hinzu
Anmerkung: TCO-NHS ist hydrophob. Wenn Sie es der Antikörperlösung hinzufügen, fügen Sie es langsam und unter Rühren hinzu, um eine Ausfällung zu verhindern. Überschreiten Sie nicht 10 Vol.-% DMF in der endgültigen Reaktionslösung.
- Die Reaktion wird bei 25 °C auf einem Thermomischer 1 h lang unter leichtem Rühren (500 U/min) inkubiert.
- Nach 1 Stunde reinigen Sie das huA33-TCO-Immunkonjugat mit einer vorverpackten Einweg-Entsalzungssäule mit Größenausschluss.
- Äquilibrieren Sie die Größenausschlusssäule wie vom Lieferanten beschrieben, um alle Konservierungsstoffe zu entfernen, die während der Lagerung in der Säule vorhanden sind. Ein typisches Verfahren besteht darin, die Säule 5x mit einem Volumen PBS zu waschen, das dem Volumen der Säule entspricht: 5 x 2,5 mL PBS.
- Fügen Sie das Reaktionsgemisch in die Spalte für den Größenausschluss hinzu und notieren Sie das Volumen des Reaktionsgemisches.
- Nachdem das Reaktionsgemisch in die Säule gelangt ist, fügen Sie eine angemessene Menge PBS hinzu, um das Gesamtvolumen der in die Säule gegebenen Lösung auf 2,5 ml zu erhöhen. Wenn die Konjugationsreaktion beispielsweise zu einem Gesamtvolumen von 1,3 ml führte, fügen Sie der Säule 1,2 ml zusätzliches PBS hinzu.
- Sammeln Sie das Produkt mit 2 ml PBS als Eluent.
Anmerkung: Dieser Schritt ergibt das endgültige Konstrukt huA33-TCO in 2 mL PBS, pH 7,4.
- Messen Sie die Konzentration des huA33-TCO mit einem UV-Vis-Spektralphotometer, das die Wellenlänge von 280 nm überwacht. Der molare Extinktionskoeffizient für die meisten IgGs (ε280) beträgt 210.000 M-1 cm-1
.
- Wenn eine Lösung mit einer höheren Konzentration an Immunkonjugat gewünscht wird, konzentriert die huA33-TCO-Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einem Cut-off-Gehalt von 50.000 Molekulargewichten gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Anmerkung: Es ist bekannt, dass viele Antikörper während der Konzentration aggregieren oder ausfallen. Wenn Forscher dieses Verfahren mit einem neuen Antikörper versuchen, sollten sie sich auf die Literatur oder ihre eigenen Erfahrungen im Umgang mit dem betreffenden Antikörper stützen.
- Lagern Sie das fertige huA33-TCO-Immunkonjugat bei 4 °C im Dunkeln, wenn es sofort benötigt wird. Wenn es länger als 4 Tage in der Zukunft verwendet werden soll, lagern Sie es bei -80 °C im Dunkeln.
Anmerkung: Dies ist ein akzeptabler Haltepunkt in der Prozedur. Das fertige huA33-TCO-Immunkonjugat sollte mindestens 6 Monate lang bei -80 °C im Dunkeln gelagert werden.
>2. Die Synthese von Tz-PEG 7-NHBoc
- In einem 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 5 mg Tetrazin-N-Hydroxysuccinimidylester (Tz-NHS; 12,6 μmol) in 0,15 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.
- In einem separaten 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 8 mg des Boc-geschützten Amino-PEG-Polymers O-(2-Aminoethyl)-O'-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylenglykol (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) in 0,15 ml wasserfreiem DMSO gelöst.
- Zur Lösung von Tz-NHS fügen Sie 3 μl (21,3 μmol, 1,7 molare Äquivalente) Triethylamin (TEA) hinzu und mischen Sie gründlich.
- Die rosa Tetrazinlösung wird in die NHBoc-PEG7-NH 2-Lösung aus Schritt 2.2 gegeben und das Reaktionsgemisch 30 min lang bei Raumtemperatur (RT) unter leichtem Rühren inkubiert.
- Nach 30 Minuten verdünnen Sie das Reaktionsgemisch 1:1 in H2O und reinigen Sie es mit Hilfe der Umkehrphasen-C 18-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), um nicht umgesetztes Tz-NHS vom Tz-PEG7-NHBoc zu trennen. Verwenden Sie Lösungsmittel ohne Säure, um eine vorzeitige Entfernung der Boc-Schutzgruppe zu verhindern. Überwachen Sie sowohl Tz-PEG 7-NHBoc als auch Tz-NHS bei einer Wellenlänge von 525 nm.
Anmerkung: Die Retentionszeiten hängen stark von der HPLC-Ausrüstung des jeweiligen Labors ab (Pumpen, Säulen, Schläuche usw.), und vor der Aufreinigung sollten geeignete Kontrollen durchgeführt werden. Um jedoch ein Beispiel zu geben: Wenn ein Gradient von 5:95 MeCN/H2O (beide ohne jegliches Additiv) zu 95:5 MeCN/H2O über 30 min, eine Flussrate von 1 mL/min und eine analytische 4,6 mm x 250 mm C18-Säule verwendet werden, betragen die Retentionszeiten von Tz-NHS und Tz-PEG 7-NHBoc etwa 16 min und 18 min. beziehungsweise.
- Frieren Sie das gesammelte HPLC-Eluent mit flüssigem Stickstoff ein und wickeln Sie das nun gefrorene Entnahmeröhrchen in Aluminiumfolie ein. Legen Sie das gefrorene Entnahmeröhrchen über Nacht auf einen Gefriertrockner, um die mobile HPLC-Phase zu entfernen. Das Produkt wird ein charakteristischer hellrosa Feststoff sein.
Anmerkung: Wenn kein flüssiger Stickstoff verfügbar ist, frieren Sie den gesammelten HPLC-Eluenten in Trockeneis oder über Nacht in einem -80 °C-Gefrierschrank ein.
>3. Die Synthese von Tz-PEG7-NH 2
- Zu dem Erzeugnis aus Schritt 2.6, Tz-PEG 7-NHBoc, werden 1,5 ml Dichlormethan (DCM) zugegeben und diese Lösung in einen kleinen Rundkolben überführt.
- Geben Sie 0,25 ml Trifluoressigsäure (TFA) tropfenweise in die rosa Lösung aus Schritt 3.1.
- Lassen Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei RT unter leichtem Rühren inkubieren.
- Nach 30 min verdampfen Sie das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung. Die Wasserbadtemperatur von 37 °C darf nicht überschritten werden.
- Rekonstituieren Sie das rosafarbene viskose Produkt in 0,5 ml Wasser.
- Reinigen Sie das Produkt mit einer Umkehrphasen-C18-HPLC, um Tz-PEG7-NH 2 von dem Boc-geschützten Vorläufer zu trennen. Überwachen Sie sowohl Tz-PEG 7-NHBoc als auch Tz-PEG7-NH 2 bei einer Wellenlänge von 525 nm.
Anmerkung: Die Retentionszeiten hängen stark von der HPLC-Ausrüstung des jeweiligen Labors ab (Pumpen, Säulen, Schläuche usw.), und vor der Aufreinigung sollten geeignete Kontrollen durchgeführt werden. Um jedoch ein Beispiel zu geben: Wenn ein Gradient von 5:95 MeCN/H2O (beide mit 0,1 % TFA) zu 95:5 MeCN/H2O über 30 min, eine Flussrate von 1 mL/min und eine analytische 4,6 mm x 250 mm C18-Säule verwendet wird, betragen die Retentionszeiten von Tz-PEG 7-NHBoc und Tz-PEG7-NH 2 etwa 18 min und 13 min. beziehungsweise.
- Frieren Sie das gesammelte HPLC-Eluent mit flüssigem Stickstoff ein und wickeln Sie das nun gefrorene Entnahmeröhrchen in Alufolie ein. Legen Sie das gefrorene Entnahmeröhrchen über Nacht auf einen Gefriertrockner, um die mobile HPLC-Phase zu entfernen. Das Produkt wird ein leuchtend rosa Feststoff sein.
- Das Produkt aus Schritt 3.7, Tz-PEG7-NH 2, mit 150 μl DMSO rekonstituieren und in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Messen Sie die Konzentration von Tz-PEG7-NH 2 mit einem UV-Vis-Spektralphotometer, das die Wellenlänge von 525 nm überwacht. Der molare Extinktionskoeffizient für Tz-PEG7-NH 2 (ε525) beträgt 535 M-1 cm-1
.
>4. Die Synthese von Tz-PEG7-DOTA
- Tz-PEG7-NH 2 (4,5 mg, 6,9 μmol) in 0,15 ml DMSO auflösen (oder mit der in Schritt 3.8 hergestellten Lösung fortfahren).
- Geben Sie 22 molare Äquivalente TEA (21 μl, 0,15 mmol) zu der Tetrazin-haltigen Lösung aus Schritt 4.1.
- Geben Sie 10 mg (14,2 μmol) p-SCN-Bn-DOTA als Feststoff hinzu und wirbeln Sie die Lösung etwa 2 Minuten lang oder bis das Material vollständig aufgelöst ist.
- Lassen Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei RT unter leichtem Rühren inkubieren.
- Nach 30 min verdünnen Sie die Reaktion 1:1 in H2O und reinigen Sie das Produkt mit Umkehrphasen-C18 HPLC, um nicht umgesetztes p-SCN-Bn-DOTA zu entfernen. Das p-SCN-Bn-DOTA kann bei einer Wellenlänge von 254 nm überwacht werden, während das Tz-PEG7-DOTA am besten bei einer Wellenlänge von 525 nm überwacht wird.
Anmerkung: Die Retentionszeiten hängen natürlich stark von der HPLC-Ausstattung des jeweiligen Labors ab (Pumpen, Säulen, Schläuche usw.), und vor der Reinigung sollten geeignete Kontrollen durchgeführt werden. Um jedoch ein Beispiel darzustellen: Wenn ein Gradient von 5:95 MeCN/H2O (beide mit 0,1 % TFA) zu 95:5 MeCN/H2O über 30 min und eine analytische 4,6 x 250 mm C18-Säule verwendet werden, weisen Tz-PEG7-DOTA und p-SCN-Bn-DOTA Retentionszeiten von etwa 15,6 min bzw. 16,1 min auf.
- Frieren Sie das gesammelte HPLC-Eluent mit flüssigem Stickstoff ein und wickeln Sie das nun gefrorene Entnahmeröhrchen in Aluminiumfolie ein. Legen Sie das gefrorene Entnahmeröhrchen über Nacht auf einen Gefriertrockner, um die mobile HPLC-Phase zu entfernen. Das Produkt wird ein leuchtend rosa Pulver sein.
- Rekonstituieren Sie das Produkt in 0,15 mL DMSO und messen Sie die Konzentration mit einem UV-Vis-Spektralphotometer, das die Wellenlänge 525 nm überwacht. Der molare Extinktionskoeffizient für Tz-PEG7-DOTA (ε525) beträgt 535 M-1 cm-1
.
- Analysieren Sie die endgültige Verbindung durch Kernspinresonanz (NMR) und hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS), um zu überprüfen, ob die Synthese erfolgreich war. In Tabelle 1 finden Sie die experimentell ermittelten chemischen Verschiebungen und Molekulargewichte aller in dieser Arbeit diskutierten Verbindungen.
- Lagern Sie die gereinigte Tz-PEG 7-DOTA-Lösung im Dunkeln bei -80 °C.
Anmerkung: Dies ist ein akzeptabler Haltepunkt in der Prozedur. Der fertige Tz-PEG 7-DOTA-Vorläufer ist unter diesen Bedingungen mindestens 1 Jahr lang stabil.
>5. 177Lu Radiomarkierung von Tz-PEG7-DOTA
VORSICHT: Dieser Schritt des Protokolls beinhaltet die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Bevor Forscher diese Schritte durchführen – oder andere Arbeiten mit Radioaktivität durchführen – sollten sich mit der Strahlenschutzabteilung ihrer Heimatinstitution beraten. Ergreifen Sie alle möglichen Maßnahmen, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren.
HINWEIS: Bei der Arbeit mit kleinen Mengen an Radiometallen wird empfohlen, dass alle Puffer frei von Spurenmetallen sind, um Interferenzen bei der Bindung an der Koordinationsstelle zu vermeiden.
- In ein 1,7-ml-Zentrifugenröhrchen werden 200 μl 0,25 M Ammoniumacetatpuffer gegeben, angepasst mit Aliquoten von 1 M HCl auf pH 5,5,
Anmerkung: Wenn für die Markierung eine Aktivität von weniger als 370 MBq verwendet wird, sollte das verwendete Puffervolumen auf 100 μl reduziert werden.
- Geben Sie die gewünschte Menge [177Lu]LuCl3 in die Pufferlösung. Die hinzugefügte Menge hängt von der Anzahl der Probanden im Experiment und den verabreichten radioaktiven Dosen ab. Es wird empfohlen, vorsichtshalber 1-2 zusätzliche Dosen Radioaktivität hinzuzufügen, um den möglichen Verlust von Radioaktivität während der Reinigungsschritte auszugleichen.
- Tz-PEG7-DOTA in DMSO zu dem radioaktiven Gemisch in Schritt 5.2 hinzufügen. Die Menge an Tz-PEG7-DOTA hängt von der Anzahl der getesteten Probanden ab. Weitere Informationen zu diesem Thema finden Sie in Schritt 6.2.2.2.
- Lassen Sie die Lösung 20 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
- Vergewissern Sie sich, dass die Radiomarkierung abgeschlossen ist, indem Sie die Radio-Instant-Dünnschichtchromatographie (Radio-iTLC) mit 50 mM EDTA und einem pH-Wert von 5,5 als mobile Phase verwenden. Das markierte [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz verbleibt auf der Basislinie — Rf = 0 —, während freies [177Lu]Lu3+ vom EDTA koordiniert wird und mit der Lösungsmittelfront Rf = 1,0 wandert (Abbildung 1B).
- Wenn die quantitative Markierung nicht erreicht wird, fügen Sie Liganden hinzu, um das freie Radiometall zu koordinieren. Alternativ können Sie das markierte [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz mit einer C18-Kartusche aufreinigen. Befolgen Sie die Gebrauchsanweisung des Herstellers. Nachfolgend finden Sie ein Beispiel für eine Vorgehensweise.
- Entlüften Sie die Kartusche, indem Sie langsam 5 ml Ethanol mit einer großen Spritze durch die Kartusche leiten. Dann passieren Sie 5 ml Acetonitril und dann 5 ml deionisiertes (DI) H2O.
- Die Radioligandenlösung aus Schritt 5.3 wird in einer kleineren Spritze aufgezogen und langsam auf die C18-Patrone injiziert. Waschen Sie dann die Kartusche mit 10 mL DI H2O, um ungebundenes [177Lu]LuCl3 zu entfernen.
- Eluieren Sie mit 500 μL Ethanol. Entfernen Sie jegliches Ethanol aus dem Endprodukt, indem Sie das Gefäß mit einer geringen Durchflussrate von trockenem Stickstoff oder Argon 10-15 Minuten lang passieren. Anschließend wird der Radioligand in Kochsalzlösung in einem in Schritt 6.2.2.2 festgelegten Volumen resuspendiert.
>6. In-vivo-Studien
VORSICHT: Wie in Abschnitt 5 beinhaltet dieser Schritt des Protokolls die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Bevor diese Schritte durchgeführt werden, sollten sich Forscher mit der Strahlenschutzabteilung ihrer Heimatinstitution beraten. Ergreifen Sie alle möglichen Maßnahmen, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren.
- Vorbereitung der Tiere
- Bei weiblichen athymischen Nacktmäusen implantieren subkutan 5 x 106 SW1222 Darmkrebszellen, die in 150 μl einer 1:1-Mischung aus Zellmedium und Matrix (z. B. Matrigel) suspendiert sind, und lassen Sie diese zu einem 100-150 mm3 Xenotransplantat heranwachsen (14-18 Tage nach der Inokulation).
- Sortierung von Tieren für ein Biodistributionsexperiment
- Sobald die Tumoren eine ausreichende Größe haben, die durch Messschiebermessung bestimmt wurde, sortieren Sie die Tiere, um sicherzustellen, dass jede Kohorte ungefähr das gleiche durchschnittliche Tumorvolumen aufweist. Die Tiere sind in jedem Käfig durch Markierungen auf dem Schwanz mit unauslöschlicher Tinte (ein Band, zwei Bänder usw.) zu unterscheiden.
- Sortierung von Tieren für eine longitudinale Therapiestudie
- Sobald die Tumore eine ausreichende Größe haben, die durch die Messung des Messschiebers bestimmt wurde, befestigen Sie Ohrmarken an jedem der Tiere, um eine korrekte Verfolgung während des gesamten Versuchs zu gewährleisten.
Anmerkung: Numerische Ohrmarken können während des gesamten Experiments abfallen. Daher wird empfohlen, diese physischen Tags systematisch mit Ohrkerben zu versehen (d. h. rechts, links, beidseitig, rechts x 2, links x 2).
- Sortieren Sie die Tiere so, dass das durchschnittliche Tumorvolumen in jeder Kohorte ungefähr gleich ist. Die folgende Methode zur Tiersortierung kann mit einem Tabellenkalkulationsprogramm durchgeführt werden.
- Listen Sie die Tieridentifikationsnummern, das Ohrkerbmuster und das Tumorvolumen in drei separaten Spalten auf.
- Sortieren Sie die Daten vom kleinsten bis zum größten Tumorvolumen.
- Weisen Sie in einer vierten Spalte jedem Tier eine Käfignummer zu und durchlaufen Sie die Käfige in einem schlangenartigen Muster. Wenn es beispielsweise 5 Käfige gibt, wird diese Spalte mit "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." gefüllt, bis allen Tieren ein Käfig zugewiesen ist.
- Nachdem die Käfige zugewiesen wurden, sortieren Sie die Daten nach Käfignummer. Wenn Ohrkerben verwendet werden, stellen Sie sicher, dass jedes Tier in einem bestimmten Käfig ein einzigartiges Ohrkerbmuster hat. Wenn Duplikate (zwei oder mehr desselben Musters) in einem bestimmten Käfig vorhanden sind, tauschen Sie eine Maus gegen eine Maus aus einem anderen Käfig mit dem fehlenden Muster aus, bis jeder Käfig Tiere mit einzigartigen Ohrkerbmustern enthält.
- Formulierungen und Injektionen
Anmerkung: Die Injektionssequenz sowohl für die Biodistributions- als auch für die Therapiestudie verläuft wie folgt: huA33-TCO wird zuerst injiziert, gefolgt von [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz nach einem vorher festgelegten Intervall.
- Immunkonjugat
- Ein Aliquot der huA33-TCO-Lösung aus Schritt 1.9 wird auf eine Konzentration von 0,8 mg/ml in 0,9 % steriler Kochsalzlösung verdünnt.
- Ziehen Sie Dosen von 150 μl (100 μg) huA33-TCO-Lösung in Spritzen, die mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS vorbehandelt sind, und lagern Sie diese Spritzen auf Eis.
Anmerkung: Die BSA-Behandlung reduziert die unspezifische Bindung des Antikörpers an die Wände der Spritze.
- Erwärmen Sie das Tier 3 Minuten lang unter einer Wärmelampe, um die Schwanzvene zu erweitern.
- Injizieren Sie die huA33-TCO-Lösung in die Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Maus. Warten Sie 24 Stunden (oder ein anderes vorgegebenes Zeitintervall), bis sich das huA33-TCO im Tumor der Maus angesammelt hat.
- Radioligand
- Radioaktive Markierung von Tz-PEG7-DOTA wie in Abschnitt 5 beschrieben.
- Ziehen Sie Dosen in 150 μl 0,9 % steriler Kochsalzlösung auf, die 1,1 molare Äquivalente von Tz-PEG7-DOTA im Verhältnis zur verabreichten Menge an huA33-TCO enthält. Wenn beispielsweise 100 μg (0,67 nmol) huA33-TCO in das Tier injiziert wurden und das [177Lu]Lu-DOTA-PEG 7-Tz-Reaktionsgemisch mit einer spezifischen Aktivität von 12,4 GBq/μmol hergestellt wurde, dann werden Dosen gezogen, die jeweils 9,14 MBq Aktivität enthalten. Dies entspricht 0,74 nmol Tz (1,1 molare Gl. relativ zu huA33-TCO).
- Erwärmen Sie die Tiere 3 Minuten lang unter einer Wärmelampe, um die Schwanzvene zu erweitern.
- Injizieren Sie die Dosis des Radioliganden in die Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Maus. Die Menge der zu injizierenden Aktivität wird vom Forscher bestimmt. Veröffentlichte Daten haben dosisabhängige therapeutische Effekte auf die Tumorgröße in einem Bereich von 7,4 - 55,5 MBq gezeigt.
