Zirkulierende miRNA-Extraktion: Eine Methode zur Isolierung von miRNA aus Plasmaproben durch organische Extraktion und Anreicherung kleiner RNA

Abstract

Quelle: Canale, M. et al., Nachweis eines zirkulierenden MicroRNA-Custom-Panels bei Patienten mit metastasiertem Darmkrebs. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die Extraktion von zirkulierender microRNA aus Plasmaproben von Darmkrebspatienten mittels organischer Extraktion, gefolgt von einer Glasfasersäulenanreicherung. miRNAs sind in biologischen Flüssigkeiten wie Serum und Plasma stabil, was sie zu idealen zirkulierenden Biomarkern für die Krebsdiagnose, Prognose und Behandlungsentscheidung und -überwachung macht. Diese Methode wird dazu beitragen, neue zirkulierende Biomarker zu identifizieren, die in der Lage sind, klinische Ergebnisse bei Patienten vorherzusagen.

Protocol

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte unter einem sterilisierten Abzug gemäß der Guten Laborpraxis (GLP) durch.

>1. Plasmasammlung und -lagerung

1. Entnehmen Sie 3 ml periphere Blutprobe in einem K3E EDTA-Röhrchen.
2. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur bei 1.880 x g für 15 min.
3. Das überstehende Plasma wird in Aliquots von 450 μl gewonnen.
4. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei -80 °C.
   HINWEIS: Verarbeiten Sie den peripheren Blutschlauch innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme. Wenn Sie das Plasma aus der Röhre gewinnen, stören Sie die Lymphozytenschicht nicht.

>2. Extraktion von zirkulierenden miRNAs aus Plasmaproben

1. Bereiten Sie alle erforderlichen Lösungen vor und tauen Sie die Proben für die Extraktionsschritte auf.
   1. 375 μl 2-Mercaptoethanol in die 2x Denaturierungslösung geben und gut mischen.
   2. Geben Sie 21 ml 100%iges Ethanol der ACS-Klasse in die miRNA-Waschlösung I und mischen Sie gut.
   3. Geben Sie 40 ml 100%iges Ethanol der Qualität ACS in die Waschlösung 2/3 und mischen Sie gut.
   4. Lassen Sie ein Plasma-Aliquot bei Raumtemperatur auftauen und beginnen Sie dann mit den Extraktionsschritten.

2. Organische Extraktion
   1. Übertragen Sie 400 μl der Plasmaprobe in ein RNase-freies 2-ml-Röhrchen.
   2. 400 μL 2x Denaturierungslösung zugeben, durch Vortexen mischen und kurz zentrifugieren.
   3. 4 μl 1 nM Spike-in zugeben, durch Vortexen mischen und kurz zentrifugieren.
   4. 800 μl saures Phenol-Chloroform zugeben.
   5. 60 s vortexen und 15 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit (≥10.000 x g) zentrifugieren.
   6. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. Stören Sie nicht die Zwischenphase. Notieren Sie sich das zurückgewonnene Volumen und verwerfen Sie das Röhrchen mit der nichtwässrigen Phase.
      Anmerkung: Die 2x Denaturierungslösung wird bei 4 °C gelagert und kann bei dieser Temperatur erstarren. Vor Gebrauch die Lösung auf 37 °C erwärmen und gelegentlich 10-15 Minuten lang umrühren. Achten Sie darauf, die untere Phase, die das saure Phenol-Chloroform enthält, und nicht den wässrigen Puffer, der auf der Mischung liegt, herauszuziehen. Die Elutionslösung oder nukleasefreies Wasser auf 95 °C vorheizen. Achten Sie darauf, ein ausreichendes Volumen der Lösung zu erhitzen (100 μl pro Probe + 10 % Überschuss).

Anreicherung kleiner RNAs
1. 1/3 des Volumens Ethanol 100 % in die wässrige Phase aus Schritt 2.2.6 geben und gründlich mischen.
2. Setzen Sie für jede Probe eine Filterpatrone in ein frisches Auffangröhrchen ein.
3. Bis zu 700 μl Lysat aus Schritt 2.3.1 und Ethanol in die Filterpatrone überführen und bei 10.000 x g für 30 s zentrifugieren.
4. Wenn noch >700 μl Gemisch übrig sind, geben Sie das Filtrat in ein frisches Röhrchen und wiederholen Sie Schritt 2.3.3; wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Gemisch die Filterpatrone durchlaufen hat.
5. Messen Sie das Gesamtvolumen des Durchflusses.
6. 2/3 des Volumens Ethanol 100% zum Filtrat hinzufügen und gründlich mischen.
7. Setzen Sie eine zweite Filterpatrone in ein frisches Auffangröhrchen ein.
8. Übertragen Sie bis zu 700 μl Probenvolumen in die Kartusche und zentrifugieren Sie sie 30 s lang bei 10.000 x g. Entsorgen Sie den Durchfluss.
9. Schritt 1.3.8 wiederholen, bis das gesamte Gemisch durch die Filterpatrone gelaufen ist.
10. Geben Sie 700 μl miRNA-Waschlösung 1 auf die Filterpatrone und zentrifugieren Sie die Filterpatrone mit dem Sammelröhrchen bei 10.000 x g für 15 s. Entsorgen Sie den Durchfluss. Setzen Sie die Filterpatrone in das gleiche Auffangröhrchen ein.
11. 500 μl Waschlösung 2/3 auf die Filterpatrone geben und die Filterpatrone mit dem Auffangrohr bei 10.000 x g für 15 s zentrifugieren. Legen Sie die Filterpatrone in ein frisches Auffangröhrchen.
12. Die Filterpatrone in ein frisches Auffangröhrchen stellen und Schritt 2.3.11 mit 500 μl Waschlösung 2/3 wiederholen. Entsorgen Sie den Durchfluss und geben Sie die Filterpatrone in ein frisches Auffangröhrchen.
13. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit den Filterpatronen bei 10.000 x g für 1 min.
14. Füllen Sie die Filterpatrone in ein frisches 1,5-ml-Sammelröhrchen und fügen Sie 100 μl vorgewärmte (95 °C) Elutionslösung oder nukleasefreies Wasser hinzu.
15. Zentrifugieren Sie 30 s lang bei 10.000 x g, um miRNAs zurückzugewinnen und bei -80 °C zu lagern.
    Anmerkung: In der Waschlösung 2/3 kann sich ein weißer Niederschlag bilden. Bei diesem Niederschlag handelt es sich um überschüssiges EDTA, das aus der Lösung freigesetzt wird. Vermeiden Sie es, diese Kristalle während der Pipettierschritte aufzusaugen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnasefreie Safe-Lock 1,5 mL Röhrchen	Eppendorf	Tel.: 0030 123.328
Rnasefreie 1000 μL-Spitzen	Starlab (Englisch)	Nr. S1122-1830
Rnasefreie Safe-Lock 2 mL Röhrchen	Eppendorf	Tel.: 0030 123.344
Rnasefreie 20 μL-Spitzen	Starlab (Englisch)	Nr. S1123-1810
Rnasefreie 200 μL-Spitzen	Starlab (Englisch)	Nr. S1120-8810
mirVana PARIS Aufreinigungskit für RNA und native Proteine	Thermo Fischer	AM1556
100 % Ethanol in ACS-Qualität	Carlo Erba Reagenzien	414605
2-Mercapto-Ethanol	Sigma-Aldrich	Nr. M3148
0,2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 μl Laborpipetten
Abzug
Tisch-Mikrozentrifuge
Wirbel