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Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Genomische DNA-Isolierung aus dem Stuhl
HINWEIS: Verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um mikrobielle DNA aus dem Stuhl nach einem Protokoll zum Nachweis von Stuhlpathogenen zu isolieren. Die Proben direkt aus dem -80 °C Gefrierschrank nehmen und während des Wiegens auf Trockeneis lagern.
- Übertragen Sie bis zu 220 mg Stuhl in ein sauberes Mikrofurge-Röhrchen mit 1,4 ml Stuhllysepuffer bei Raumtemperatur (RT) (siehe Materialtabelle).
- Die Probe 1 Minute lang vortexen, um die Feststoffe gründlich zu homogenisieren (Abbildung 1B). Die Suspension wird 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, um alle Bakterien (einschließlich grampositiver Bakterien) zu lysieren.
- Proben 15 s lang vortexen und dann 1 min bei 20.000 x g zentrifugieren, um die Feststoffe des Stuhls zu pelletieren. Überstand in ein 2 mL Mikrofugenröhrchen überführen. Geben Sie eine Tablette zu jeder Probe, um PCR-Inhibitoren zu absorbieren, wirbeln Sie, bis sich die Tablette aufgelöst hat, und inkubieren Sie die Probe 1 Minute lang bei RT.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 20.000 x g für 3 min und überführen Sie den Überstand in ein neues Mikroschleierröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 3 min. Aliquotieren Sie 15 μl Proteinase K (20 mg/ml-Stamm) in ein neues 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen. Pipettieren Sie 200 μl der Probe in das Röhrchen, das die Proteinase K enthält.
- 200 μl Guanidiniumchlorid-Lysepuffer in das Röhrchen geben, 15 s gründlich vortexen (siehe Materialtabelle) und die Probe 10 min lang bei 70 °C inkubieren. 200 μl Ethanol (96-100 %) in die Röhrchen geben und durch Vortexen gut mischen.
- Legen Sie eine Spin-Säule auf Siliziumdioxidbasis in ein 2-ml-Sammelröhrchen und geben Sie die Proben auf die Säule. Den Deckel schließen und 1 min bei 20.000 x g zentrifugieren.
- Füllen Sie die Säule in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen und geben Sie 500 μl Waschpuffer 1 in die Säule, verschließen Sie die Säule und zentrifugieren Sie sie 1 Minute lang bei 20.000 x g. Übertragen Sie die Säule in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen und geben Sie 500 μl Waschpuffer 2 in die Säule. Den Deckel schließen und bei 20.000 x g 3 min zentrifugieren.
- Bei geschlossener Kappe die Säule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen umfüllen und weitere 1 Minute bei 20.000 x g zentrifugieren, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen. Übertragen Sie die Säule in ein 1,5 mL markiertes Mikrofugenröhrchen und eluieren Sie die Probe, indem Sie der Membran 200 μl Elutionspuffer mit EDTA zusetzen (siehe Materialtabelle).
- Schließen Sie die Kappe und inkubieren Sie 1 Minute lang bei RT. Zentrifugieren Sie die Probe 1 Minute lang bei 20.000 x g. Entsorgen Sie die Säule.
>2. Bestimmung der DNA-Konzentration und Probenvorbereitung für die PCR
HINWEIS: Verwenden Sie ein Fluorometer und einen kommerziell erhältlichen dsDNA-Fluoreszenz-Assay, um die genomische DNA-Konzentration in jeder Probe zu bestimmen (siehe Materialtabelle). Der Fluoreszenzfarbstoff muss doppelsträngige DNA spezifisch binden.
- Bereiten Sie eine Verdünnung jeder Probe im Verhältnis 1:200 (1 μl jeder Probe in einem 199 μl dsDNA-Mastermix) und eine Verdünnung der Standards im Verhältnis 1:50 vor. Analysieren Sie auf einem Fluorometer mit der dsDNA-Einstellung.
Hinweis: Ein hohes DNA-Volumen in der PCR kann hemmend wirken, daher darf das verwendete DNA-Volumen nicht mehr als 10 % des endgültigen Volumens der PCR betragen. Ein Fluorometer ermöglicht eine genaue Messung der DNA in der Probe, da nur DNA, die an den Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist, fluoresziert, wodurch der mögliche Beitrag von Verunreinigungen zur endgültigen berechneten DNA-Konzentration ausgeschlossen wird. Dieses Maß an genauer Quantifizierung ist für die Downstream-Sequenzierungsanwendung unerlässlich.
- Bereiten Sie PCR-Templates vor, die auf 5 ng/μl mit dem entsprechenden Volumen von 10 mM Tris, pH 8,5 verdünnt sind, um für jede Probe funktionierende Template-Bestände zu erstellen.
- Lagern Sie die Proben bei -20 °C.
>3. Design-Primer für die gewünschten 16S V-Bereiche
- Entwerfen Sie Primer, um die gewünschten V 16S rRNA-Regionen selektiv zu amplifizieren.
- Analysieren Sie Primer mit Probe Match aus dem Ribosomal Database Project, um die ungefähre Trefferquote für verschiedene Stämme zu bestimmen.
Hinweis: Für die V1-V3-Regionen wurden in der aktuellen Studie die veröffentlichten Primer Bosshard forward verwendet, die an Position 8 innerhalb der V1-Region binden, und 533 reverse, die an Position 533 innerhalb der V3-Region binden. Primer müssen Überhangadaptersequenzen für die Indizierung enthalten.
- Bei der Entwicklung von Primern sollten Adaptersequenzen an den 5'-Enden jedes Primers eingefügt werden, wie es für die Vorbereitung der 16S-Metagenomik-Sequenzierungsbibliothek empfohlen wird (Tabelle 1).
- Synthetisieren Sie diese großen Primer mit Kartuschenreinigung. Rekonstituieren Sie getrocknete Primer und verdünnen Sie ein PCR-Arbeitsmaterial auf 1 μM in 10 mM Tris, pH 8,5.
>4. Amplikon-PCR zur Amplifikation der V-Region(en) mit angehängten Überhang-Adapter-Sequenzen
- Richten Sie den Amplikon-PCR-Reaktionsmix wie in Tabelle 2 beschrieben ein.
- Platzieren Sie ein selbstklebendes, durchsichtiges PCR-Plattensiegel auf der Platte und führen Sie die Amplikon-PCR mit den Parametern in Tabelle 3 durch.
- (Optional) Führen Sie Amplikon-PCR-Produkte auf einem Agarosegel oder einem hochempfindlichen DNA-Assay durch, der die quantitative Messung der Amplikongröße ermöglicht (siehe Materialtabelle).
Hinweis: Die Amplikongröße aus dieser Studie beträgt 550 bp (Abbildung 2a).
>5. PCR-Aufreinigung mit magnetischen Beads
- Zentrifugieren Sie die Amplikon-PCR-Platte schnell bei 1.000 x g für 1 min, um Kondenswasser aufzufangen.
Anmerkung: PCR-Röhrchenstreifen können anstelle von PCR-Platten verwendet werden, um die Kontamination zu minimieren. Entsorgen Sie Tubendeckel und verwenden Sie sie niemals wieder.
- Wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen vor, um sie gleichmäßig zu verteilen, und fügen Sie 20 μl magnetische Kügelchen zu jeder Amplikon-PCR-Vertiefung hinzu, dann pipettieren Sie das gesamte Volumen langsam 10 Mal auf und ab.
- 5 Minuten bei RT inkubieren. Legen Sie die PCR-Platte 2 Minuten lang auf einen Magnetständer, bis die magnetischen Kügelchen gesammelt sind und der Überstand klar ist. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Waschen Sie die Kügelchen mit 200 μL frischem 80%igem Ethanol, während sich die PCR-Platte auf dem Magnetständer befindet, und inkubieren Sie 30 s lang bei RT auf dem Magnetständer. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal. Verwenden Sie nun eine feine Pipettenspitze, um das restliche Ethanol aus den Vertiefungen zu entfernen, und lassen Sie es 10 Minuten lang an der Luft trocknen.
- Nehmen Sie die PCR-Platte vom Magnetständer und geben Sie 52,5 μl 10 mM Tris pH 8,5 in jede Vertiefung. Pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um die Kügelchen aufzuhängen, und inkubieren Sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Übertragen Sie die PCR-Platte auf das Magnetstativ, um magnetische Kügelchen zu sammeln, und übertragen Sie 50 μl des Überstands auf eine saubere PCR-Platte. Legen Sie eine selbstklebende, durchsichtige PCR-Plattenversiegelung auf die Platte und lagern Sie sie bis zu einer Woche bei -20 °C.
| Amplikon-PCR-Primer |
| vorwärts | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| Rückwärts | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| Locus-spezifische Sequenzen werden fett dargestellt und die nicht fettgedruckte ist die Überhang-Adapter-Sequenz. |
Tabelle 1: Amplikon-PCR-Primer.
| Aufbau der Amplikon-PCR-Reaktion | |
| Volumen |
| Mikrobielle DNA (5ng/μl) | 2,5 μl |
| Vorwärtsprimer (1 μM; aus Schritt 3.1) | 5,0 μl |
| Reverse Primer (1 μM; aus Schritt 3.1) | 5,0 μl |
| 2X HotStart Fertigmischung | 12,5 μl |
| gesamt | 25,0 μl |
Tabelle 2: Amplikon-PCR-Primer.
| Amplikon-PCR eingerichtet |
| 95 °C für 3 Minuten | |
| 25 Zyklen von: | |
| 95 °C für 30 Sekunden |
| 55 °C für 30 Sekunden |
| 72 °C für 60 Sekunden |
| 72 °C für 3 Minuten | |
| Bei 4 °C halten | |
Tabelle 3: Einrichtung des Amplikon-PCR-Programms.
