1. Erzeugung der CRC-Organoide, die auf künstlicher extrazellulärer Matrix kultiviert wurden
Experimentelle Verfahren für die Darmkrebs-Organoidkultur der Dickdarm-PDXs sind in Abbildung 1B (Schritt 4) dargestellt.
- Etablierung eines Kulturmediums, das für die PDX-abgeleiteten CRC-Organoide geeignet ist (siehe Materialtabelle, "das CRC-Organoid-Kulturmedium"), unter Verwendung von Medien, die zuvor für menschliche Dickdarmorganoide beschrieben wurden.
- Tragen Sie 150 μl künstliche extrazelluläre Matrix (siehe Materialtabelle) pro Vertiefung auf eine 12-Well-Platte auf Eis auf und inkubieren Sie sie dann 30-60 Minuten lang in einem 37 °C, 5% CO2 -Inkubator, um die Gele zu verfestigen.
- Das Zellpellet von Darmkrebszellen, das aus dem PDX-Mausmodell gewonnen wurde, mit dem Darmkrebs-Organoid-Kulturmedium (aus Schritt 1.1) mit 5 % FCS suspendieren, um es auf 3 x 105 Zellen/ml einzustellen. Anschließend wird 1 ml des Mediums auf die in Schritt 1.2 hergestellte künstliche, mit extrazellulärer Matrix beschichtete Platte gesät und über Nacht bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubiert. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Tumorzellen zu zählen, einschließlich einzelner Zellen und mehrzelliger Cluster (eine Gruppe von adhärenten Zellen) in der Zellsuspension.
HINWEIS: 5% FCS wird in dieser Studie verwendet, um die enzymatische Restaktivität der Kollagenase zu löschen.
- Sammeln Sie das Nährmedium, einschließlich der schwimmenden Zellen, die von der künstlichen, mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platte gelöst wurden, am nächsten Tag vorsichtig in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 1.400 x g. Entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 70 μl künstlicher extrazellulärer Matrix auf Eis.
- Um die Lebensfähigkeit der Darmkrebszellen zu erhöhen, überlagern Sie die tumorzellhaltige künstliche extrazelluläre Matrix mit den Tumororganoidzellen, die an der mit künstlicher extrazellulärer Matrix beschichteten Platte befestigt sind, und inkubieren Sie 30 Minuten lang in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator, um die künstliche extrazelluläre Matrixbeschichtung zu verfestigen. Inkubieren Sie es dann mit 1 ml des Organoid-Zellkulturmediums für Darmkrebs mit 1 % FCS bei 37 °C unter 5 % CO2.
- Wechseln Sie den Nährboden jeden zweiten Tag. Da die Darmkrebs-Organoide das Medium füllen, kann es notwendig werden, das Medium täglich zu wechseln.
>2. Erzeugung und Anreicherung von GFP lentiviralen Partikeln
Experimentelle Verfahren zur Erzeugung und Anreicherung von GFP-lentiviralen Partikeln sind in Abbildung 1C (Schritt 5) dargestellt.
- Kultivieren Sie HEK293T Zellen mit einem Medium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), das 10 % FCS enthält, und bereiten Sie sechs 10-cm-Schalen (2 x 106 Zellen pro Schale) für das folgende Transfektionsverfahren vor.
- Für die Transfektion pro Schale bereiten Sie 500 μl der Mischung einschließlich 20 μl des Transfektionsreagenzes in DMEM mit einem PRRL-GFP-Vektor (5 μg) und zwei lentiviralen Verpackungsplasmiden, wie z. B. pCMV-VSV-G (1 μg) und pCMV-dR8,2 dvpr (5 μg), in einem sterilen 1,5-ml-Mikroröhrchen vor. Die Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren und dann auf jede der 10-cm-Schalen legen und 18 Stunden inkubieren.
- Nehmen Sie das Medium heraus, geben Sie 5 ml frisches 10 % FCS-RPMI 1640 Medium in jede Schale und lassen Sie es 24 Stunden lang stehen.
- Sammeln Sie das konditionierte Medium aus jeder Schale in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie insgesamt 30 mL des Mediums über Nacht bei 4 °C. 5 ml des frischen RPMI 1640 auf jede Schale geben und 24 Stunden ziehen lassen.
- Sammeln Sie das konditionierte Medium aus jeder Schale in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und halten Sie insgesamt 30 ml des Mediums auf Eis. Verwerfen Sie dann die Zellen.
- Filtrieren Sie 60 mL des Mediums (aus den Schritten 2.4-2.5) durch einen 0,45 μm Filter, um die Zellen zu entfernen, und verteilen Sie diese Menge auf zwölf 5 mL Polypropylen-Zentrifugenröhrchen für die Ultrazentrifugation.
- Um Viren zu konzentrieren, zentrifugieren Sie sie mit einem schwingenden Schaufelrotor bei 85.327 x g für 1,5 h bei 4 °C.
- Entfernen Sie sofort das Medium. Um das konzentrierte Viruspellet aufzulösen, geben Sie 250 μl Nährschinkenmischung F-12 (F12)/DMEM-Medium ohne FCS in jedes der zwölf Röhrchen und halten Sie es über Nacht bei 4 °C. Beachten Sie, dass das Viruspellet oft unsichtbar ist.
- Pipettieren Sie das Medium vorsichtig, um insgesamt 3 ml des konzentrierten 5x GFP-Lentivirus-Stammes zu sammeln, vermutlich einschließlich GFP-Lentiviruspartikeln mit 108 Transduziereinheiten pro ml (TU/ml). Lagern Sie dann die zwölf 1,5-ml-Mikroröhrchen (einschließlich 250 μl pro Röhrchen) unter sterilen Bedingungen bei -80 °C für bis zu einem Jahr. Bereiten Sie viele kleine Aliquots der ursprünglichen Lösung vor, um mehrfache Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
>3. Markierung von Darmkrebs-Organoidzellen mit GFP-Lentiviruspartikeln, die auf künstlicher extrazellulärer Matrix kultiviert wurden
Experimentelle Verfahren zur Markierung der Darmkrebs-Organoidzellen mit GFP-Lentiviren sind in Abbildung 1C (Schritt 6) dargestellt.
- Lassen Sie die in Schritt 1.6 hergestellten CRC-Organoide 7-10 Tage lang ungestört wachsen, ernten Sie sie mechanisch mit einem sterilen Zellschaber und überführen Sie sie in ein 1,5 mL Mikroröhrchen.
Anmerkung: Das Wachstum von Darmkrebs-Organoiden in Kultur hängt von der Art der ursprünglichen Tumoren von Patienten ab. Vermeiden Sie ein Überwachsen der Darmkrebs-Organoide, indem Sie sie bei 60-70 % Konfluenz halten, bevor sie in einem Split-Verhältnis von 1:2 auf eine neue, mit künstlicher extrazellulärer Matrix beschichtete 12-Well-Platte übertragen werden.
- Zentrifugieren Sie das Mikroröhrchen 3 min lang bei 1.400 x g, entfernen Sie das Kulturmedium und lösen Sie das Zellpellet in 500 μl PBS durch sanftes Klopfen auf.
- Zentrifugieren Sie das Mikroröhrchen 3 Minuten lang bei 1.400 x g und eliminieren Sie PBS.
- Um die anhaftenden CRC-Organoide zu dissoziieren, geben Sie 500 μl einer Zellablösungslösung aus proteolytischen und kollagenolytischen Enzymen zu dem Zellpellet in der Tube und mischen Sie es durch sanftes Klopfen. Lassen Sie die Röhrchen dann 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
- Pipettieren Sie die Zellsuspension sehr vorsichtig mit zusätzlichen 500 μL 1% FCS-DMEM mehrmals in einem 1,5 mL Mikroröhrchen, um die Zellen grob zu dissoziieren. Die Erzeugung einzelner Zellen aus den Darmkrebs-Organoiden durch hartes Pipettieren verringert die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich. Daher ist es wichtig, die Masse der Zellen in der Zellsuspension visuell nachweisbar zu lassen, indem ein 1,5 mL Mikroröhrchen vorsichtig hineinpipettiert wird.
- Die Zellsuspension wird 3 min lang bei 1.400 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
- Das Zellpellet wird mit einer Mischung aus 100 μl 5x GFP-Lentivirusstamm (>108 TU/ml) und 400 μl des CRC-Organoid-Kulturmediums in einem 1,5 ml-Mikroröhrchen durch leichtes Klopfen auf eine Konzentration von 5 x 105 dissoziierten Tumorzellen pro 500 μl aufgelöst. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Tumorzellen zu zählen. einschließlich einzelner Zellen und Zellgruppen in der Zellsuspension, wie oben beschrieben (Schritt 1.3).
- Bereiten Sie eine künstliche, mit extrazellulärer Matrix beschichtete 12-Well-Platte vor, wie in Schritt 1.2 beschrieben. Anschließend werden 500 μl der in Schritt 3.7 hergestellten Zellsuspension auf die Platte gegeben und 18 h bei 37 °C unter 5 % CO2 gelagert.
- Sammeln Sie das Medium mit den schwimmenden Zellen, die von der künstlichen, mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platte gelöst sind, in einem 1,5-ml-Zentrifugationsröhrchen. Zentrifugieren Sie es bei 1.400 x g, entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 70 μl künstlicher extrazellulärer Matrix auf Eis.
- Um die Lebensfähigkeit von Darmkrebszellen zu erhöhen, überlagern Sie die tumorzellhaltige künstliche extrazelluläre Matrix mit den Tumororganoiden, die an die mit künstlicher extrazelluläre Matrix beschichtete 12-Well-Platte gebunden sind, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Inkubieren Sie die Platte anschließend 30 Minuten lang in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator, um die künstliche extrazelluläre Matrixbeschichtung zu verfestigen, und kultivieren Sie sie dann mit 1 ml des CRC-Organoid-Kulturmediums mit 1 % FCS bei 37 °C unter 5 % CO2.
- Beobachten Sie die Zellen drei Tage nach der Infektion unter einem Fluoreszenzmikroskop, um eine nahezu 100%ige GFP-Positivität aufgrund der Verwendung eines hohen Titers an lentiviralen Partikeln zu bestätigen (siehe Abbildung 2A).
- Kultivieren Sie die CRC-Organoide 7-10 Tage lang, um das Zellwachstum zu erweitern, bevor Sie sie in Empfängermäuse injizieren.
