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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Dissektion von CRC PDXs aus Mäusen
Experimentelle Verfahren zur Dissektion von CRC PDXs sind in Abbildung 1B (Schritt 2) dargestellt.
- Lassen Sie den Tumor subkutan auf eine Größe von ~1 cm3 wachsen, was in der Regel etwa 1-3 Monate dauert.
- Betäuben Sie die Maus mit der Isofluran-Inhalation mit dem Kleintier-Inhalationsanästhesiegerät und desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol.
- Legen Sie die Maus in Bauchlage auf den Labortisch. Schneiden Sie die Haut ein, legen Sie den Tumor frei und lösen Sie die Haut vorsichtig mit einer sterilen Schere vom Tumor. Nachdem Sie den Tumor entfernt haben, legen Sie ihn auf eine 10 cm große Petrischale, entfernen Sie alle grob nekrotischen Regionen aus dem Tumor und spülen Sie ihn dann zweimal mit 5 mL PBS aus.
Anmerkung: Nekrotische Gebiete sind oft weißer, weicher und brüchiger als die umliegenden Gebiete.
- Legen Sie den Tumor auf Eis und teilen Sie ihn gleichmäßig in mindestens 4 Teile für verschiedene Anwendungen, einschließlich 1) der CRC-Organoidkultur, 2) der Transplantation in Sekundärmäuse, 3) der histologischen Untersuchung und 4) dem Einfrieren und Lagern der Tumorfragmente.
- Für die Erzeugung der CRC-Organoide legen Sie das solide Tumorgewebe auf eine 6 cm große Petrischale, die 1 mL steriles PBS enthält. Bewahren Sie das Taschentuch bis zur Verarbeitung auf Eis auf.
- Um das PDX-Modell für menschliches CRC zu etablieren, leiten Sie die frischen CRC-PDXs in eine zweite Maus ein. Schneiden Sie das Tumorgewebe mit sterilen Rasierklingen in kleine Stücke (5 x 5 x 5 mm,3 in der Größe) und tauchen Sie diese Gewebefragmente vorsichtig in 50 μL künstliche extrazelluläre Matrix. Implantieren Sie diese Fragmente dann in die unteren Teile der rechten und linken Unterhauttasche der NOG-Maus.
- Legen Sie die anästhesierte Maus in Bauchlage auf den Labortisch. Machen Sie einen kleinen Schnitt an den unteren Teilen der rechten und linken Flanke der Empfängermaus, um mit einer sterilen Schere subkutane Taschen für die Gewebeimplantation zu erzeugen. Achten Sie darauf, die Bauchfellmembran nicht zu durchstechen. Bei diesem Verfahren sollte es zu geringen Blutungen kommen.
- Tauchen Sie die oben vorbereiteten Tumorfragmente vorsichtig in 50 μl künstliche extrazelluläre Matrix und implantieren Sie sie dann in die unteren Teile der rechten und linken Unterhauttasche.
- Nähen Sie den Schnitt mit Wundclips bei Mäusen, die sich chirurgischen Eingriffen unterziehen. Es ist darauf zu achten, dass sich das implantierte Tumorgewebe in einiger Entfernung vom Schnitt unter der Haut befindet.
Anmerkung: In Übereinstimmung mit der Minimierung chirurgischer Eingriffe wurden in dieser Studie keine Behandlungen für postoperative Schmerzen und Infektionen durchgeführt.
- Legen Sie die Maus auf ein warmes Pad und halten Sie die sternale Liegeposition aufrecht, bis Sie wieder ausreichend Bewusstsein haben. Sobald sie sich vollständig erholt haben und in der Lage sind, auf allen vier Beinen zu sitzen, können die Mäuse in ihre Heimatkäfige zurückgebracht werden. Um Raubtiere zu vermeiden, erlauben Sie keine Zucht mit nicht operierten Tieren im selben Käfig.
- Für die histologische Analyse fixieren Sie die Proben in 5 ml 10 % neutralem gepuffertem Formalin in einem konischen 15-ml-Röhrchen bei Raumtemperatur für 2 Tage.
- Schneiden Sie für die Kryokonservierung das Tumorgewebe in kleine Stücke (5 x 5 x 5 mm3 groß) und tauchen Sie die Proben vorsichtig in 500 μl Zellgefrierlösung in 1-1,5 mL Kryoröhrchen. Stellen Sie das Rohr dann in einen -80 °C Gefrierschrank.
>2. Extraktion von PDXs in die Zellsuspension für die CRC-Organoidkultur
Experimentelle Verfahren zur Dissoziation von SFB-PDXen sind in Abbildung 1B (Schritt 3) dargestellt.
- Legen Sie die oben (Schritt 1.4.1) vorbereiteten Tumorfragmente auf eine 10 cm große Petrischale.
- Zerkleinern Sie die Fragmente mit sterilen Rasierklingen und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 8 ml 10 % fötalem Kälberserum (FCS) - Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 80 μl Kollagenase-Enzymbestand (siehe Materialtabelle).
- Verschließen Sie die Tube fest und umwickeln Sie die Kappe mit Parafilm, um ein Auslaufen zu verhindern. Um die zerkleinerten Tumorfragmente in die Zellsuspension zu dissoziieren, rühren Sie diese 2 h lang bei 37 °C vorsichtig um. Beachten Sie, dass noch viele Fragmente von unverdautem Gewebe in der Röhre verbleiben.
- Das Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Lösen Sie das Zellpellet mit 10 ml 10 % FCS-DMEM auf, um die Zellsuspension herzustellen.
- Um unverdaute Gewebereste zu entfernen, filtrieren Sie die Zellsuspension zweimal mit dem 40-μm-Zellsieb auf einem konischen 50-ml-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet auf Eis.
>3. Generierung der CRC-Organoide, die auf künstlicher extrazellulärer Matrix kultiviert wurden
Experimentelle Verfahren für die Darmkrebs-Organoidkultur der Dickdarm-PDXs sind in Abbildung 1B (Schritt 4) dargestellt.
- Etablierung eines Kulturmediums, das für die PDX-abgeleiteten CRC-Organoide geeignet ist (siehe Materialtabelle, "das CRC-Organoid-Kulturmedium"), unter Verwendung von Medien, die zuvor für menschliche Dickdarmorganoide beschrieben wurden.
- Tragen Sie 150 μl künstliche extrazelluläre Matrix (siehe Materialtabelle) pro Vertiefung auf eine 12-Well-Platte auf Eis auf und inkubieren Sie sie dann 30-60 Minuten lang in einem 37 °C, 5% CO2 -Inkubator, um die Gele zu verfestigen.
- Suspendieren Sie das Zellpellet aus Schritt 2.5 mit dem CRC-Organoid-Kulturmedium (aus Schritt 3.1) mit 5 % FCS, um eine Anpassung auf 3 x 105 Zellen/ml zu erreichen. Anschließend wird 1 ml des Mediums auf die in Schritt 3.2 vorbereitete, künstliche, mit extrazellulärer Matrix beschichtete Platte gesät. und über Nacht bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Tumorzellen zu zählen, einschließlich einzelner Zellen und mehrzelliger Cluster (eine Gruppe von adhärenten Zellen) in der Zellsuspension.
HINWEIS: 5% FCS wird in dieser Studie verwendet, um die enzymatische Restaktivität der Kollagenase zu löschen.
- Sammeln Sie das Nährmedium, einschließlich der schwimmenden Zellen, die von der künstlichen, mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platte gelöst wurden, am nächsten Tag vorsichtig in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 1.400 x g. Entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 70 μl künstlicher extrazellulärer Matrix auf Eis.
- Um die Lebensfähigkeit der Darmkrebszellen zu erhöhen, überlagern Sie die tumorzellhaltige künstliche extrazelluläre Matrix mit den Tumororganoidzellen, die an der mit künstlicher extrazellulärer Matrix beschichteten Platte befestigt sind, und inkubieren Sie 30 Minuten lang in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator, um die künstliche extrazelluläre Matrixbeschichtung zu verfestigen. Inkubieren Sie es dann mit 1 ml des Organoid-Zellkulturmediums für Darmkrebs mit 1 % FCS bei 37 °C unter 5 % CO2.
- Wechseln Sie den Nährboden jeden zweiten Tag. Da die Darmkrebs-Organoide das Medium füllen, kann es notwendig werden, das Medium täglich zu wechseln.
>4. Erzeugung und Anreicherung von GFP lentiviralen Partikeln
Experimentelle Verfahren zur Erzeugung und Anreicherung von GFP-lentiviralen Partikeln sind in Abbildung 1C (Schritt 5) dargestellt.
- Kultivieren Sie HEK293T Zellen mit einem Medium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), das 10 % FCS enthält, und bereiten Sie sechs 10-cm-Schalen (2 x 106 Zellen pro Schale) für das folgende Transfektionsverfahren vor.
- Für die Transfektion pro Schale bereiten Sie 500 μl der Mischung einschließlich 20 μl des Transfektionsreagenzes in DMEM mit einem PRRL-GFP-Vektor (5 μg)12 und zwei lentiviralen Verpackungsplasmiden, wie z. B. pCMV-VSV-G (1 μg) und pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg), in einem sterilen 1,5-ml-Mikroröhrchen vor. Die Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren und dann auf jede der 10-cm-Schalen legen und 18 Stunden inkubieren.
- Nehmen Sie das Medium heraus, geben Sie 5 ml frisches 10 % FCS-RPMI 1640 Medium in jede Schale und lassen Sie es 24 Stunden lang stehen.
- Sammeln Sie das konditionierte Medium aus jeder Schale in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie insgesamt 30 mL des Mediums über Nacht bei 4 °C. 5 ml des frischen RPMI 1640 auf jede Schale geben und 24 Stunden ziehen lassen.
- Sammeln Sie das konditionierte Medium aus jeder Schale in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und halten Sie insgesamt 30 ml des Mediums auf Eis. Verwerfen Sie dann die Zellen.
- Filtern Sie 60 mL des Mediums (aus den Schritten 4.4-4.5) durch einen 0,45 μm Filter, um die Zellen zu entfernen, und verteilen Sie diese Menge auf zwölf 5 mL Polypropylen-Zentrifugenröhrchen für die Ultrazentrifugation.
- Um Viren zu konzentrieren, zentrifugieren Sie sie mit einem schwingenden Schaufelrotor (siehe Materialtabelle) bei 85.327 x g für 1,5 h bei 4 °C.
- Entfernen Sie sofort das Medium. Um das konzentrierte Viruspellet aufzulösen, geben Sie 250 μl Nährschinkenmischung F-12 (F12)/DMEM-Medium ohne FCS in jedes der zwölf Röhrchen und halten Sie es über Nacht bei 4 °C. Beachten Sie, dass das Viruspellet oft unsichtbar ist.
- Pipettieren Sie das Medium vorsichtig, um insgesamt 3 ml des konzentrierten 5x GFP-Lentivirus-Stammes zu sammeln, vermutlich einschließlich GFP-Lentiviruspartikeln mit 108 Transduziereinheiten pro ml (TU/ml). Lagern Sie dann die zwölf 1,5-ml-Mikroröhrchen (einschließlich 250 μl pro Röhrchen) unter sterilen Bedingungen bei -80 °C für bis zu einem Jahr. Bereiten Sie viele kleine Aliquots der ursprünglichen Lösung vor, um mehrfache Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
>5. Markierung von Darmkrebs-Organoidzellen mit GFP lentiviralen Partikeln, die auf künstlicher extrazellulärer Matrix kultiviert wurden
Experimentelle Verfahren zur Markierung der Darmkrebs-Organoidzellen mit GFP-Lentiviren sind in Abbildung 1C (Schritt 6) dargestellt.
- Lassen Sie die in Schritt 3.6 hergestellten CRC-Organoide 7-10 Tage lang ungestört wachsen, ernten Sie sie mechanisch mit einem sterilen Zellschaber und überführen Sie sie dann in ein 1,5 mL Mikroröhrchen.
Anmerkung: Das Wachstum von Darmkrebs-Organoiden in Kultur hängt von der Art der ursprünglichen Tumoren von Patienten ab. Vermeiden Sie ein Überwachsen der Darmkrebs-Organoide, indem Sie sie bei 60-70 % Konfluenz halten, bevor sie in einem Split-Verhältnis von 1:2 auf eine neue, mit künstlicher extrazellulärer Matrix beschichtete 12-Well-Platte übertragen werden.
- Zentrifugieren Sie das Mikroröhrchen 3 min lang bei 1.400 x g, entfernen Sie das Kulturmedium und lösen Sie das Zellpellet in 500 μl PBS durch sanftes Klopfen auf.
- Zentrifugieren Sie das Mikroröhrchen 3 Minuten lang bei 1.400 x g und eliminieren Sie PBS.
- Um die anhaftenden CRC-Organoide zu dissoziieren, geben Sie 500 μl einer Zellablösungslösung aus proteolytischen und kollagenolytischen Enzymen zu dem Zellpellet in der Tube und mischen Sie es durch sanftes Klopfen. Lassen Sie die Röhrchen dann 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
- Pipettieren Sie die Zellsuspension sehr vorsichtig mit zusätzlichen 500 μL 1% FCS-DMEM mehrmals in einem 1,5 mL Mikroröhrchen, um die Zellen grob zu dissoziieren. Die Erzeugung einzelner Zellen aus den Darmkrebs-Organoiden durch hartes Pipettieren verringert die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich. Daher ist es wichtig, die Masse der Zellen in der Zellsuspension visuell nachweisbar zu lassen, indem ein 1,5 mL Mikroröhrchen vorsichtig hineinpipettiert wird.
- Die Zellsuspension wird 3 min lang bei 1.400 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
- Das Zellpellet wird mit einer Mischung aus 100 μl 5x GFP-Lentivirus-Stamm (>108 TU/ml) und 400 μl des CRC-Organoid-Kulturmediums in einem 1,5 ml-Mikroröhrchen durch leichtes Klopfen auf eine Konzentration von 5 x 105 dissoziierten Tumorzellen pro 500 μl aufgelöst. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Tumorzellen zu zählen. einschließlich einzelner Zellen und Zellgruppen in der Zellsuspension, wie oben beschrieben (Schritt 3.3).
- Bereiten Sie eine künstliche, mit extrazellulärer Matrix beschichtete 12-Well-Platte vor, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Anschließend werden 500 μl der in Schritt 5.7 hergestellten Zellsuspension auf die Platte gegeben und 18 h bei 37 °C unter 5 % CO2 stehen gelassen.
- Sammeln Sie das Medium mit den schwimmenden Zellen, die von der künstlichen, mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platte gelöst sind, in einem 1,5-ml-Zentrifugationsröhrchen. Zentrifugieren Sie es bei 1.400 x g, entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 70 μl künstlicher extrazellulärer Matrix auf Eis.
- Um die Lebensfähigkeit von Darmkrebszellen zu erhöhen, überlagern Sie die tumorzellhaltige künstliche extrazelluläre Matrix mit den Tumororganoiden, die an die mit künstlicher extrazelluläre Matrix beschichtete 12-Well-Platte gebunden sind, wie in Schritt 3.5 beschrieben. Inkubieren Sie die Platte anschließend 30 Minuten lang in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator, um die künstliche extrazelluläre Matrixbeschichtung zu verfestigen, und kultivieren Sie sie dann mit 1 ml des CRC-Organoid-Kulturmediums mit 1 % FCS bei 37 °C unter 5 % CO2.
- Beobachten Sie die Zellen 3 Tage nach der Infektion unter einem Fluoreszenzmikroskop, um eine nahezu 100%ige GFP-Positivität aufgrund der Verwendung eines hohen Titers an lentiviralen Partikeln zu bestätigen (siehe Abbildung 2A).
- Kultivieren Sie die CRC-Organoide 7-10 Tage lang, um das Zellwachstum zu erweitern, bevor Sie sie in Empfängermäuse injizieren.
>6. Erzeugung von Metastasen durch GFP-markierte CRC-Organoide in Empfängermäusen
Experimentelle Verfahren zur Erzeugung von Metastasen mit den GFP-markierten CRC-Organoiden sind in Abbildung 1C (Schritt 7) dargestellt.
- Um die GFP-markierten CRC-Organoide in die Zellsuspension zu dissoziieren, ernten Sie sie mechanisch mit einem sterilen Zellschaber und überführen Sie sie in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen, wie oben beschrieben (Schritt 5.1).
- Zentrifugieren Sie das Mikroröhrchen 3 Minuten lang bei 1.400 x g, entfernen Sie das Kulturmedium und lösen Sie das Zellpellet in 500 μl PBS durch sanftes Klopfen auf.
- Zentrifugieren Sie das Mikroröhrchen 3 Minuten lang bei 1.400 x g und eliminieren Sie PBS.
- 500 μL der Zellablösungslösung auf das Zellpellet im Röhrchen aufbringen und durch leichtes Klopfen mischen. Lassen Sie die Mischung dann 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um die anhaftenden CRC-Organoide enzymatisch zu dissoziieren, wie oben beschrieben (Schritt 5.4).
- Pipettieren Sie die Zellsuspension sehr vorsichtig mit zusätzlichen 500 μl 1% FCS-DMEM mehrmals in ein 1,5 mL Mikroröhrchen, um die Zellen grob zu dissoziieren, wie oben beschrieben (Schritt 5.5). Die Erzeugung einzelner Zellen aus den Darmkrebs-Organoiden durch hartes Pipettieren verringert die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich. Lassen Sie also die Masse der Zellen in der Zellsuspension visuell nachweisbar, indem Sie vorsichtig ein 1,5-ml-Mikroröhrchen einpipettieren.
- Die Zellsuspension wird 3 min lang bei 1.400 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
- Um ein Mausmodell für spontane Metastasen von CRC PDXs zu etablieren:
- Bereiten Sie eine Zellsuspension vor, die 5 x 105 Zellen in 50 μl PBS mit 50 % künstlicher extrazellulärer Matrix pro Maus enthält. Halten Sie die Suspension vor dem Gebrauch auf Eis. Verwenden Sie ein Hämozytometer zur Zählung der Krebszellen, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
- Betäuben Sie eine Maus mit Isofluran-Inhalation mit dem Kleintier-Inhalationsanästhesiegerät und desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, dass die normale Geschwindigkeit und Tiefe der Atmung und das Fehlen eines Zehenquetschreflexes für eine ordnungsgemäße Anästhesie vorhanden sind. Tierärztliche Salbe auf den Augen ist eine Option, um Augentrockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Legen Sie die NOG-Maus in Rückenlage auf den Labortisch. Fassen Sie die Rektumschleimhaut mit einer sterilen Pinzette an und ziehen Sie sie vorsichtig aus dem After heraus. Anschließend wird die in Schritt 6.7.1 hergestellte Zellsuspension sofort mit einer Spritze (Nadelstärke: 22 G) in die rektale Submukosa der Maus injiziert. Routinemäßig werden 4-6 Mäuse pro Gruppe verwendet, um die Ergebnisse zu bewerten.
