Etablierung eines experimentellen Metastasen-Mausmodells: Implantation von GFP-exprimierenden CRC-Organoidzellen in das PDX-Modell zum Nachweis von Mikrometastasen

Zusammenfassung

Quelle: Okazawa, Y. et al. Hochempfindliche Detektion von Mikrometastasen, die von GFP-Lentivirus-transduzierten Organoiden erzeugt wurden, die aus einem vom Patienten stammenden Dickdarmtumor kultiviert wurden. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Erzeugung von Metastasen durch die PDX-abgeleiteten CRC-Organoide, die mit GFP-Lentiviren markiert wurden, in die Milz einer immundefizienten Maus. Krebsmikrometastasen, die andere Organe besiedeln, können mit einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden, um die GFP-Expression zu beurteilen.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Erzeugung von Metastasen durch GFP-markierte CRC-Organoide in Empfängermäusen

1. Um ein experimentelles Metastasenmodell von CRC PDXs zu etablieren:
   1. Bereiten Sie eine Darmkrebs-Organoid-Zellsuspension vor, die 4 x 10⁴ Zellen in 50 μl PBS pro Maus enthält. Halten Sie die Suspension vor dem Gebrauch auf Eis. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Krebszellen zu zählen. (Zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen, einschließlich Einzelzellen und multizellulärer Cluster in der Zellsuspension).
   2. Betäuben Sie eine Maus mit Isofluran-Inhalation mit dem Kleintier-Inhalationsanästhesiegerät und desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, dass die normale Geschwindigkeit und Tiefe der Atmung und das Fehlen eines Zehenquetschreflexes für eine ordnungsgemäße Anästhesie vorhanden sind. Tierärztliche Salbe auf den Augen ist eine Option, um Augentrockenheit während der Narkose zu verhindern.
   3. Legen Sie die anästhesierte NOG-Maus in Bauchlage auf den Labortisch. Machen Sie einen kleinen Schnitt am unteren Teil der linken Flanke und schneiden Sie dann das Bauchfell, um die Milz vorsichtig mit einer sterilen Schere und Pinzette freizulegen. Fassen Sie das an der Milz befestigte Fettgewebe mit einer sterilen Pinzette an und injizieren Sie dann langsam 50 μl der Zellsuspension (hergestellt wie oben, Schritt 1.1) in die Milz. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension ordnungsgemäß und ohne Leckage nach außen aus der Milz injiziert wird. Routinemäßig werden 4 Mäuse pro Gruppe verwendet, um die Ergebnisse zu bewerten.
2. Legen Sie alle Mäuse nach der Operation auf ein warmes Polster und halten Sie sie in einer sternalen Liegeposition, bis das Bewusstsein wiederhergestellt ist. Sobald sich die Mäuse vollständig erholt haben und in der Lage sind, auf allen vier Beinen zu sitzen, bringen Sie sie in ihre Heimatkäfige zurück. Um Raubtiere zu vermeiden, erlauben Sie keine Zucht mit nicht operierten Tieren im selben Käfig.
3. Überprüfen Sie, ob die Nähte undicht sind, und bestätigen Sie am nächsten Tag, dass die Mäuse in der chirurgisch behandelten Gruppe am Leben sind. Untersuchen Sie die Mäuse auf Krankheitsanzeichen und messen Sie die Tumorgröße bei allen Mäusen einmal pro Woche mit Messschiebern.
4. Beobachten Sie Mäuse auf spontane Metastasen (für einen Zeitraum von bis zu 2,5 Monaten) und experimentelle Metastasen (1 Monat) nach der Injektion
.
5. Opfern Sie die Mäuse an den angegebenen Tagen über Narkose und Gebärmutterhalsluxation. Präpariere Primärtumoren und verschiedene Gewebe, einschließlich Leber und Lunge. Legen Sie die präparierten Tumore und Organe in 5 mL eiskaltem PBS auf eine 10 cm Petrischale und lagern Sie sie auf Eis.
6. Um GFP-positive Darmkrebs-Organoidzellen nachzuweisen, betrachten Sie das präparierte Gewebe unter einem Stereofluoreszenzmikroskop. Erfassen Sie Bilder mit einer CCD-Kamera und bereiten Sie sie mit Standard-Bildverarbeitungssoftware vor

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) Mäuse	Das Zentralinstitut für Versuchstiere, Kanagawa, Japan	Züchten Sie 6 Wochen alte männliche Mäuse unter keimfreien und spezifisch pathogenfreien Bedingungen
gewickelte Clips 2×10mm	Natsume Manufacturing, Japan	#C-21-S	Vor Gebrauch autoklavieren
Hamilton Spritzennadelgröße:22 Gauge	Tokyo Science, Japan	Mit 70% Alkohol und sterilem PBS desinfizieren.
50 ml konisches Röhrchen	Sumitomo Bakelit	Nr. MS-57500
Mikroröhrchen	Eppendorf	#0030120086	Vor Gebrauch autoklavieren
Hämozytometer	Erma	#03-202-1
Organoid-Kulturmedium für Darmkrebs mit 1 % oder 5 % FCS			DMEM/F-12 mit GlutaMAX-Supplement™ (Gibco #10565018), ergänzt mit 1 % oder 5 % FCS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 ng/ml hEGF und 10 μM Y27632, einem ROCK-Inhibitor. Bei 4°C lagern. Innerhalb von 1 Monat verbrauchen.
ein Zeiss Axioplan 2 Stereofluoreszenzmikroskop	Zeiss