Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Lokale Tumorinduktion via Chirurgische Adeno-cre-Infektion
- Vorbereitung der Tiere für die Operation
HINWEIS: Praktisch jede bedingte ("floxierte") Mutation kann mit der hier beschriebenen Methode induziert werden. Empfohlen wird die Verwendung von Mutationen in Genen, die für Darmkrebs relevant sind, wie z.B. Apc, Kras oder Tp53. Die Effizienz der Cre-Rekombination hängt von der Größe des zu exzidierenden Konstrukts ab. Große gefloxte Sequenzen werden weniger effizient exzidiert. Die Rekombination aller Allele sollte in den Tumoren PCR bestätigt werden.
- Für die Entwicklung kolorektaler Tumoren verwenden Sie eine Kreuzung der folgenden bedingten Allele für ein Basismodell von CRC (MGI-Datenbanknummer in Klammern):
Apctm2Rak (MGI: 3688435)
Krastm4Tyj (MGI: 2429948)
tp53tm2Tyj (MGI: 3039263)
- Wenn ein Fluoreszenz-Reporter-Allel benötigt wird (, z.B. , um Mikrometastasen zu erkennen), verwenden Sie das folgende Allel:
Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze (MGI: 3809522)
HINWEIS: Alle oben genannten Stämme sind über das NCI Mouse Repository oder das Jackson Laboratory erhältlich. Es ist kein Fasten erforderlich, da alle verbleibenden Fäkalien vor der adenoviralen Infektion ausgespült werden können. Präoperatives Fasten führt zu einer höheren perioperativen Mortalität und stellt für kleine Nagetiere eine enorme Belastung dar.
- Verwenden Sie Sevofluran in einer Menge von 3 - 3,5 Vol.-% für die Vollnarkose. Ein Verlust des Zehenquetschreflexes deutet auf eine ausreichende Narkose hin.
- Vor dem ersten Schnitt sind 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan zu injizieren.
- Decken Sie die Augen der betäubten Maus mit einer Augensalbe ab, um ein Austrocknen der Hornhaut zu vermeiden.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf einen kleinen Tisch. Verwenden Sie nicht-traumatische Klebebänder, um die Maus festzuhalten.
- Rasieren Sie den Bauch mit einem Elektrorasierer (alternativ kann Enthaarungscreme verwendet werden) und desinfizieren Sie ihn mit Alkoholtupfern oder Jod. Nutzen Sie die vom Hersteller empfohlene Einwirkzeit.
- Decken Sie das Operationsfeld mit sterilen Abdecktüchern ab.
HINWEIS: Die Verwendung von perioperativen Antibiotika ist optional und unterliegt den institutionellen Richtlinien.
- Verwenden Sie sterile Einweginstrumente oder sterilisierte Instrumente für alle chirurgischen Eingriffe.
- Mittellinien-Laparotomie und Freilegung des Dickdarms
- Verwenden Sie eine Schere (Skalpelle können alternativ verwendet werden), um einen Mittellinienschnitt (~ 15 mm) auf der Haut des Unterbauchs zu machen.
- Nehmen Sie die Bauchwandmuskulatur mit einer Pinzette auf und schneiden Sie sie vorsichtig mit einer Schere ein, wodurch die Bauchhöhle geöffnet wird.
- Identifizieren Sie den distalen Dickdarm, berühren Sie ihn nur mit einer atraumatischen Pinzette. Klemmen Sie den Dickdarm mit einer filigranen Klemme (, z. B. , einer Micro Serrefine Gefäßklemme) etwa 15 mm proximal des Anus.
HINWEIS: Achten Sie immer besonders auf die Verletzlichkeit des Doppelpunkts. Eine Perforation führt unweigerlich zu Bauchfellentzündung und Sepsis und erfordert die Euthanasie des Tieres.
- Segmentale Dickdarminfektion mit dem Adeno-cre-Virus
- Führen Sie einen flexiblen Teflonschlauch transanal ein und schieben Sie ihn vorsichtig vor, bis er den Lumenverschluss erreicht, der durch die zuvor 15 mm vom Analrand platzierte Klemme erreicht wird. Wenden Sie keine übermäßige Kraft an, da dies zu Perforationen führen kann.
- Kanülieren Sie den Schlauch mit einer 30G-Kanüle, schließen Sie eine Standard-1-ml-Spritze an und spülen Sie den Dickdarm mit normaler Kochsalzlösung, um die restlichen Fäkalien zu entfernen. Dies kann mehrere ml Kochsalzlösung erfordern.
- Sobald der distale Dickdarm leer ist, entfernen Sie den Schlauch und ersetzen Sie ihn durch einen frischen Teflonschlauch und positionieren Sie ihn wieder direkt distal der Klemme, wie oben beschrieben.
- Den Dickdarm mit einer zweiten Klemme ~ 3 mm distal zur proximalen Klemme (d.h. , über dem eingeführten Schlauch, ~ 12 mm vom Analrand entfernt) verschließen, wodurch ein 3 mm isoliertes Segment entsteht, das infiziert werden soll.
HINWEIS: Für die distale Okklusion des Segments haben sich Fogarty-Koronararterienclips als am besten geeignet erwiesen, da sie gummiert sind, was trotz des intraluminalen Schlauchs zwischen den Ästen der Klemme zu einem engen Verschluss des Dickdarms führt.
- Verwenden Sie eine zweite Spritze (Standard 1 mL mit einer 30G-Kanüle), um vorsichtig 50 - 80 μl 0,25% Trypsin-EDTA in das geklemmte Dickdarmsegment zu injizieren und 10 Minuten lang zu inkubieren. Lassen Sie die Kanüle und die Spritze am Teflonschlauch befestigt, um ein Zurücklaufen der Flüssigkeit zu verhindern.
HINWEIS: Der Dickdarm muss aufgebläht werden, um die Schleimhautbarriere aufzubrechen und die kryptischen Stammzellen zu erreichen, aber nicht zu aufgebläht, um eine Perforation des eingeklemmten Segments zu vermeiden.
- Entfernen Sie zuerst die distale Klemme und dann das Trypsinröhrchen.
- Spülen Sie den distalen Dickdarm mit ~ 500 μl normaler Kochsalzlösung, um das restliche Trypsin zu entfernen.
- Setzen Sie einen neuen Teflonschlauch ein, setzen Sie die distale Klemme wieder ein und blasen Sie das Dickdarmsegment mit 50 - 80 μl adenoviraler Lösung (1011 plaquebildende Einheiten (PFU)/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) auf und inkubieren Sie für 30 min (Abbildung 2A).
HINWEIS: Verschütten Sie keine virale Lösung, da der Kontakt mit Adeno-cre zur Tumorentwicklung in jeglichem Gewebe von bedingt mutierten Mäusen führen kann.
- Entfernen Sie die Klemmen und den Schlauch.
- Verschluss des Abdomens und postoperative Genesung
- Die Bauchdecke mit 6-0 schnell resorbierbaren Laufnähten (z.B. , Polydioxanon (PDS)) verschließen.
- Verschließen Sie die Haut mit chirurgischen Wundklammern.
- Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, das auf 38 °C eingestellt ist, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
- Verabreichen Sie 12 h nach der Operation einen weiteren Bolus von 0,05 mg/kg Buprenorphin i.p.p., gefolgt von zusätzlichen Buprenorphin-Boli alle 12 Stunden, falls erforderlich.
- Überwachen Sie die Mäuse mindestens einmal täglich auf Anzeichen von Stress aufgrund von Tumorwachstum.
2. Koloskopie
HINWEIS: Abhängig von den verwendeten bedingten Mutationen führt eine adenovirale Infektion innerhalb von 2 - 4 Wochen zu endoskopisch sichtbaren Tumoren. Führen Sie daher die erste postoperative Koloskopie 2 Wochen nach der adenoviralen Induktion durch und wiederholen Sie sie alle 2 Wochen. Für die murine Koloskopie wird ein kommerziell erhältliches System empfohlen.
- Vorbereitung von Tieren für die Koloskopie
HINWEIS: Es ist kein Fasten erforderlich. Der restliche Stuhl befindet sich in der Regel gut im distalen Dickdarm und kann bei der Darmspiegelung über den Tumor hinaus geschoben werden, wodurch der belastende Prozess des wiederholten Fastens überflüssig wird.
- Verwenden Sie Sevofluran in einer Menge von 3 - 3,5 Vol.-% für die Vollnarkose. Ein Verlust des Zehenquetschreflexes deutet auf eine ausreichende Narkose hin.
- Bedecken Sie die Augen der betäubten Mäuse mit einer Augensalbe, um ein Austrocknen der Hornhaut zu vermeiden.
- Halten Sie die Mäuse in Rückenlage auf einem kleinen Tisch fest.
- Koloskopie
- Führen Sie das Endoskop (Durchmesser 1,9 mm; Länge 10 cm) durch den Anus in den Darmtrakt ein und insufflieren Sie vorsichtig Luft unter Sichtkontrolle, um den Dickdarm zu dehnen. Instrudeln Sie nicht mehr Luft als für die Untersuchung erforderlich.
HINWEIS: Für die Luftinsufflation kann die Anti-Beschlag-Luftpumpe des Koloskopiesystems verwendet werden. Wenn keine Anti-Beschlag-Luftpumpe zur Verfügung steht, kann eine andere Luftpumpe mit sehr niedrigen Druckeinstellungen verwendet werden oder Druckluft mit einem empfindlichen Druckminderventil. Kohlendioxid (CO2) führt bei kleinen Nagetieren leicht zu einer Übersäuerung und muss daher vermieden werden.
- Schieben Sie das Endoskop vorsichtig nach vorne, bis eine Schleimhautläsion im distalen Dickdarm identifiziert werden kann (Abbildung 1A - 1D).
- Speichern Sie endoskopische Bilder für eine spätere Auswertung. Ein endoskopisches Scoring-System für intraluminale Tumoren wurde bereits beschrieben.
- Entfernen Sie vorsichtig das Zielfernrohr und legen Sie die Maus auf ein auf 38 °C eingestelltes Heizkissen, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
