1. Mikrotubuli-bindender Assay
- Für den Mikrotubuli-Bindungsassay ~1 x 106 HCT 116-Zellen in 100-mm-Gewebekulturschalen geben, die das Minimum Essential Media (MEM) enthalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. Nach einem Tag der Kultivierung erreichen die Zellen eine Konfluenz von 60-70%.
- Bereiten Sie 1X (2 mL) PEM-Puffer aus 10X PEM-Puffer vor, der bei 4 °C gelagert wurde, indem Sie 20 μM (40 μL) Paclitaxel und 1 mM (20 μL) GTP hinzufügen. Entnehmen Sie die Mikrotubuli (MT)-Brühe aus dem -80 °C-Gefrierschrank und die E. coli tau-Arbeitsstoffe aus dem -20 °C-Gefrierschrank.
- Bereiten Sie die Proben gemäß Tabelle 1 vor.
- 30 min bei 37 °C inkubieren. 60 min bei 25 °C bei 100.000 x g ultrazentrifugieren.
- 120 μl Überstände, die ungebundenes Tau enthalten, werden in saubere und markierte Röhrchen überführt.
- Geben Sie 120 μl (gleiches Volumen wie der Überstand) 5X Probenpuffer zu dem Pellet, das gebundenes Tau enthält, und mischen Sie es gründlich. Füllen Sie die Lösung in saubere, etikettierte Röhrchen und mischen Sie sie gründlich.
- Messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay unter Verwendung kommerzieller Protein-Assay-Kits.
Anmerkung: Bei der Probenvorbereitung ist das Lösungsvolumen (Schritt 1.6) sowohl für die Pellet- als auch für die Überstandsprobe zu verwenden.
- Bereiten Sie Proben mit äquivalenter Proteinkonzentration vor und fügen Sie frisch zubereiteten 4x SDS-Gel-Loading-Puffer mit DTT (400 mM) hinzu.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei -20 °C gelagert werden.
- Inkubieren Sie die Proben auf einem Heizblock bei 100 °C für 5 min. Mischen Sie die Proben mit einem Wirbel. Bei Raumtemperatur ~10-15 min abkühlen lassen.
- Stellen Sie ein Elektrophoresesystem zusammen, um ein 10%iges Polyacrylamid-Gel mit SDS-PAGE zu betreiben.
- Laden Sie 10 μg Protein (13 μl Probe) pro Well auf ein 10 % Polyacrylamid-Gel. Laden Sie die Molekulargewichtsleiter.
- Schließen Sie nach dem Laden der Probe die positiven und negativen Elektroden des Elektrophoresesystems an eine Stromquelle an, um eine konstante Spannung aufrechtzuerhalten. Beginnen Sie zunächst 20 Minuten lang bei 70 V, um die Proteinproben aus dem Stapelgel in das Auflösungsgel zu bewegen. Erhöhen Sie dann die Spannung auf 125 V und lassen Sie das Gel ca. 70-120 Minuten lang laufen, bis die Proben und die Proteinleiter das Ende des Gels erreichen.
- Nach Abschluss der Elektrophorese wird das Gel mit einem Nass-Elektroblotting-System auf eine PVDF-Membran übertragen. Transfer für ~100 min bei 100 V.
- Markieren Sie den Blot, indem Sie einen kleinen Schnitt an der Seite der Molekulargewichtsleiter machen. Verwende eine durchsichtige Plastikfolie und einen scharfen Cutter, um den Klecks zu schneiden.
- Blockieren Sie die Membran in 4% BSA-Blockierungspuffer für 90 min bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie den Blot über Nacht in einer Primärantikörperlösung (Anti-Tau bei 1:5.000) bei 4 °C. Waschen Sie den Tupfer viermal zu je 7 Minuten in PBST.
- Bereiten Sie die entsprechende Sekundärantikörperlösung vor (Ziegen-Anti-Maus-IgG bei 1:5.000) und inkubieren Sie den Blot 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Viermal à 7 min in PBST waschen.
- Entwickeln Sie den Blot mit einem Chemilumineszenz-Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Decken Sie den Klecks mit transparenter Plastikfolie ab. Erfassen Sie Bilder mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem für die Chemilumineszenz mit der entsprechenden Software.
Tabelle 1: Probenvorbereitung für den Mikrotubuli-Bindungsassay.
| Probe | Name | Mikrotubuli benötigt | Benötigtes Hauptprotein | PEM-GTP-PTX |
| 1 | HCT 116-Steuerung (6,21 μg/μl) | 2 μl | 9,66 μl (60 μg) | 108,34 μl |
| arabische Ziffer | HCT 116-Curcumin 10 μM (4,81 μg/μl) | 2 μl | 16,63 μl (80 μg) | 101,37 μl |
| 3 | HCT 116-Curcumin 20 μM (3,28 μg/μl) | 2 μl | 30,49 μl (100 μg) | 87,51 μl |
| 4 | HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) | 2 μl | 18,42 μl (100 μg) | 99,58 μl |
| 5 | E. coli tau | 2 μl | 1 μl Tau-352 | ca. 117 μl |
| 6 | Nur MT | 2 μl | X | 118 μl |
| | | | je 120 μl |
