Methodenartikel

CTC-Isolierung aus einer Vollblutprobe: Eine Methode zur Gewinnung von CTCs aus dem Modell des murinen Darmkrebses

30. April 2023

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Kochall, S., et al. Isolierung zirkulierender Tumorzellen in einem orthotopen Mausmodell für Darmkrebs. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen aus der Vollblutprobe eines euthanasierten kolorektalen Tumormausmodells. Diese isolierten CTCs können kultiviert und für die vorgesehene Downstream-Analyse verwendet werden.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen aus Vollblutproben

HINWEIS: Blutgewinnung durch transkutane Herzpunktion an anästhesierten Mäusen, gefolgt von Euthanasie. Im Idealfall werden 1.000 μl Blut in eine Spritze gesaugt, die mit 100 μl eines Antikoagulans (Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Heparin) vorgefüllt ist. Verwenden Sie einen Anti-Human-EpCAM-Antikörper (Epithelzelladhäsionsmolekül), um die CTCs zu identifizieren. Das funktioniert sehr gut, wenn humane Epithelzelllinien im Mausmodell verwendet werden. Für andere Anwendungen können andere Antikörper erforderlich sein.

  1. CTC-Anreicherung:
    1. Füllen Sie 15 mL Röhrchen mit 5 mL Dichtegradientenmedium vor und überführen Sie das Blut vorsichtig in das 15 mL Röhrchen.
    2. Zentrifugieren (30 min bei 300 x g ohne Bremse) und den oberen Überstand vorsichtig entfernen.
    3. Den Rest in ein neues 15-ml-Röhrchen geben und zentrifugieren (15 min, 300 x g mit Bremse).
    4. Die Interphase mit den mononukleären Zellen wird zurückgewonnen (der Rest wird verworfen) und die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen.
    5. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl PBS/1 % EDTA und fügen Sie 4 μl EpCAM-Antikörper hinzu. 20 min im Dunkeln auf Eis inkubieren.
  2. Siebung und Kommissionierung
    1. Bereiten Sie folgenden Puffer (im Folgenden als Picking-Puffer bezeichnet) vor: PBS + 10 % fötales Kälberserum (FCS) + 1 % Penicillin/Streptomycin (1 %) + 0,8 % EDTA.
    2. Zeichnen Sie mit einem PAP-Pen einen ~1 cm großen Kreis in einer 6 cm sterilen Petrischale (verhindert, dass sich die Flüssigkeit in der Schale verteilt) und pipettieren Sie 700 μl Picking-Puffer in diesen Kreis.
    3. Geben Sie 50 μl Zellsuspension in den 700 μl Picking-Puffer innerhalb des Kreises. Überprüfen Sie die Dichte der Zellen mit dem Mikroskop. Teilen Sie die Probe in verschiedene Schalen auf, wenn sie zu dicht ist.
    4. Warten Sie, bis sich die Zellen beruhigt haben (~5 min).
    5. Siebt den Tropfen der Zellsuspension auf gefärbte (= EpCAM-positive) Zellen.
    6. Sobald eine Zelle gefunden wurde, entnehmen Sie die Zelle mit dem Mikromanipulator und legen Sie sie in einen 50-μl-Puffer, abhängig von der beabsichtigten nachgelagerten Analyse (z. B. RNA-Extraktionspuffer oder Kulturmedium).
    7. Abhängig von den beabsichtigten nachgelagerten Analysen werden EpCAM-negative Zellen und/oder Medien als Negativkontrollen isoliert.
    8. Fahren Sie mit nachgelagerten Analysen (z. B. Zellkultur, PCR) fort.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dichtegradient mittel – FicollStammzelle - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon 9C4BioLegendeArtikel-Nr.: 324210
Alexa Fluor 488 Anti-Maus CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon G8.8BioLegendeArtikel-Nr.: 118210
Petrischale, ø 60 x 15 mm, 21 cm², VentGreiner bio-one628102
Fluoreszenz-ZellkulturmikroskopLeica
Transferman 4r MikromanipulatorEppendorf
CellTram AirEppendorfAspirationspumpe, die mit dem Mikromanipulator verbunden ist
Dmz Universeller MikroelektrodenabzieherDagan Corporation (Englisch)Erforderlich für die Herstellung von Mikrokapillaren für die Einzelzellaspiration
Prismenglas KapillarenDagan Corporation (Englisch)
PAP-StiftAbcam (Englisch
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung von DulbeccoLife Technologies GmbH14190169Kommissionier-Puffer
Fötales Kälberserum (FCS)BIOCHROM AGNr. 0115Kommissionier-Puffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122Kommissionier-Puffer
EdtaRoth8040.1Kommissionier-Puffer
Immunhistochemie
Aufgereinigter Anti-Human-CD326 (EpCAM)-Antikörper-Klon 9C4BioLegende324201EpCAM-Immunhistochemie
HRP Kaninchen Anti-Maus IgGAbcam (EnglischArtikel-Nr.: ab97046EpCAM-Immunhistochemie
) )

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Zirkulierende TumorzellenDichtegradientzentrifugationAnti EpCAM Antik rperFluoreszenzmikroskopieperiphere mononukle re BlutzellenEpCAM positive ZellenMikromanipulationstechnikPBS Waschschrittehydrophober Markerstift

Verwandte Artikel