$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Organotypische Präparation:
Herstellung des mit Fibroblasten imprägnierten organotypischen Gels:
- Bereiten Sie eine Fibroblasten-Zellsuspension vor, die 5 x 105 Zellen pro Organotypikum in DMEM enthält, ergänzt mit 10 % FCS und 292 μg/ml L-Glutamin.
- Stellen Sie die organotypischen Gele auf Eis in folgenden Verhältnissen her:
- • 7 Volumina Rat-Tail Collagen: Matrigel-Mischung (1:1)
- • 1 Volumen gefiltertes 10x DMEM
- • 1 Volumen FCS
- • 1 Volumen Fibroblasten-Zellsuspension mit 5 x 105 Fibroblasten
Für 9 Gele (1 ml pro Gel) 10 ml vorbereiten und vorsichtig mischen, um Blasen zu vermeiden.
- Geben Sie 1 ml in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre, damit die Gele aushärten können. Geben Sie nach 1 Stunde 1 ml DMEM (10% FCS)/Glut auf die Gele und kehren Sie über Nacht in den Inkubator zurück.
- Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium von der Oberseite der Gele und die Platte 1 ml des Mediums, das 5 x 105 CRC-Epithelzellen enthält.
Vorbereitung von gelbeschichteten Nylonplatten:
- Bereiten Sie im Voraus sterile, autoklavierte Nylonplatten mit den Maßen 1,5 cm x 1,5 cm vor.
- Legen Sie mit einer sterilen Pinzette die erforderliche Anzahl von Nylonblättern in eine 10 cm große Kulturschale (in der Regel können 4 Nylonblätter pro Schale aufgenommen werden).
- Make up Gel auf Eis in folgender Reihenfolge (pro Nylonblatt werden 250 μl Gesamtvolumen benötigt):
- • 7 Volumen Rattenschwanz-Kollagen
- • 1 Volumen gefiltertes 10x DMEM
- • 1 Volumen FCS
- • 1 Volumen DMEM 10% FCS/Glut
- Wenn die Lösung gelb ist, neutralisieren Sie sie durch Zugabe von 0,1 M NaOH in 50 μl Aliquoten, bis die Lösung rosa wird.
- Geben Sie 250 μl dieser Lösung zu jeder Nylonplatte und inkubieren Sie bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 für 30 Minuten, damit das Gel aushärten kann.
- Make-up 1% Glutaraldehydlösung in PBS. Sobald das Gel fest geworden ist, 10 ml in jede 10-cm-Kulturschale geben und 1 Stunde lang bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Nylonplatten 3x in PBS und 1x in DMEM (10% FCS)/Glu und inkubieren Sie sie über Nacht in DMEM/Glu bei 4 °C.
Aufziehen organotypischer Gele auf Stahlgitter für die Invasion:
- Bereiten Sie Gerüstgitter vor, indem Sie Edelstahlbleche zu einer Stativformation falten. Vor Gebrauch autoklavieren.
- Verwenden Sie eine in Ethanol sterilisierte Pinzette, um ein Stahlgitter in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu platzieren.
- Legen Sie eine gelbeschichtete Nylonfolie mit der Kollagenseite nach oben auf jedes Gitter.
- Übertragen Sie die organotypischen Gele vorsichtig mit einem in Ethanol sterilisierten Spatel von der 24-Well-Platte auf die erhabene Nylonfolie.
- Füllen Sie die Vertiefung mit DMEM 10 % FCS/Glut, ergänzt mit 10 % FCS, bis die Nylonfolie mit dem Medium in Kontakt kommt, aber nicht untergetaucht ist. Achten Sie darauf, dass das Medium das organotypische Gel nicht berührt.
- 14 Tage lang bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubieren, wobei das Medium alle 2 Tage ausgetauscht wird.
2. Organotypische Fixierung
- Die gesamte organotypische Folie einschließlich Nylonfolie aus der Vertiefung nehmen und auf Frischhaltefolie legen.
- Organotypische und Nylonfolie mit einem sauberen Einwegskalpell halbieren und beide Hälften 24 Stunden bei Raumtemperatur in Formaldehyd fixieren.
- Ersetzen Sie Formaldehyd nach 24 Stunden durch 70%iges Ethanol und lassen Sie es über Nacht einwirken, bevor Sie es in Paraffin einbetten, schneiden und färben.
3. Lasermikrodissektion des invasiven Randes
- Schnitt bis 10 μm Dicke auf membranmontierte Objektträger.
- Entparaffinieren Sie die Abschnitte, indem Sie 1 Minute lang Xylol auftragen, dann Xylol entfernen und 75 % Ethanol für weitere 1 Minute fixieren.
- Entfernen Sie das Ethanol und färben Sie es 1 Minute lang mit 0,125%iger Cresylviolett-Lösung. Cresylviolett hebt Epithelzellen hervor und ermöglicht eine einfache Unterscheidung vom Stroma.
- Cresyl Violet entfernen und weitere 1 Minute mit 100 % Ethanol auftragen, bevor Sie mit 100 % Ethanol spülen. Lassen Sie die Dias 30 Minuten lang an der Luft trocknen.
- Führen Sie die Lasermikrodissektion mit der gewählten Plattform (z. B. dem Leica AS-System) durch.
- Legen Sie den Objektträger mit dem zu mikropräparierenden Teil mit der Vorderseite nach unten auf den Mikroskoptisch.
- Montieren Sie ein 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in die Entnahmekassette und geben Sie 50 μl Zelllysepuffer (z. B. DNA-, RNA- oder Proteinlysepuffer) in die Kappe, in der sich das mikropräparierte Gewebe sammelt.
- Verwenden Sie unter direkter Sicht den Joystick, um das gewünschte Gewebe zu identifizieren. Mit der Softwareschnittstelle können Sie den gefärbten organischen Schnitt annotieren und die Zellen hervorheben, die an der Tumorinvasionsfront mikrodispariert werden sollen.
- Weisen Sie den Laser an, zu feuern, wodurch sowohl der markierte Abschnitt ausgeschnitten als auch mikrodispariertes Gewebe in die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchens geschleudert wird.
- Sobald genügend Material gesammelt wurde, werfen Sie die Auffangkassette aus, schließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie es vorsichtig, um den Lysepuffer an den Boden des Röhrchens zu ziehen.
- Legen Sie die Proben auf Eis, bis die Mikrodissektion abgeschlossen ist. Verarbeiten Sie Proben mit einer geeigneten Methode, um den interessierenden Analyten zu extrahieren.