Traktionszytometrie-Assay: Eine Methode zur Quantifizierung der Zugkraft, die von Krebszellen auf die EZM ausgeübt wird

Abstract

Quelle: Ali, M. Y., et al. Isolierung von primären menschlichen Dickdarmtumorzellen aus chirurgischem Gewebe und Kultivierung direkt auf weichen elastischen Substraten für die Traktionszytometrie. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video beschreibt den Zugkraftmikroskopie-Assay. Der Assay bestimmt die zelluläre Traktion von menschlichen Dickdarmkrebszellen auf der extrazellulären Matrix, die auf einem weichen, elastischen Hydrogel mit eingebetteten fluoreszierenden Kügelchen vorhanden ist. Die resultierende Verschiebung der fluoreszierenden Kügelchen wird mit einer entsprechenden Software gemessen.

Protocol

>1. Traktionskraftmikroskopie-Assay

1. 0,25 %ige Trypsin-EDTA/10 %ige SDS-Lösung bei 37 °C in einem Wasserbad 10 Minuten lang erwärmen, bevor die Traktionsversuche beginnen.
2. Entnehmen Sie jeweils ein Gel (PA-Gele und Glas mit ECM-Molekülen funktionalisieren, humanes Fibronektin in einer Konzentration von 50 μg/ml) aus dem Zellkultur-Inkubator und legen Sie es auf den fluoreszierenden inversen Mikroskoptisch (32-fache Vergrößerung).
3. Suchen Sie eine einzelne Zelle im Sichtfeld. Nehmen Sie den Deckel der Petrischale ab.
4. Nehmen Sie ein Phasenkontrastbild der Zelle auf (z. B. Abbildung 1).
5. Schalten Sie den Bildgebungsmodus auf Fluoreszenz und wählen Sie den passenden Filter aus. Bewegen Sie während dieser Zeit weder den Mikroskoptisch noch die Probe.
6. Machen Sie ein Bild der fluoreszierenden Kügelchen, die durch zelluläre Traktion verdrängt werden (Abbildung 2C).
7. Geben Sie 1 ml Trypsin/SDS-Lösung in die Petrischale, um die Zelle vom Gel zu lösen. Bewegen Sie während dieser Zeit weder den Mikroskoptisch noch die Probe. Machen Sie außerdem ein Kontrollbild der Zelle, um eine vollständige Entfernung aus dem Gel sicherzustellen.
8. Nehmen Sie ein Referenzbild (Nullkraft) der Perlen auf, nachdem die Zelle entfernt wurde.
9. Wiederholen Sie die Schritte 1.2-1.8 für alle anderen Gele.
10. Erstellen Sie mit ImageJ einen Image-Stack aus den beiden Images, die in den Schritten 1.6 und 1.8 für jeden Fall erfasst wurden. Um den Bildstapel zu generieren, verwenden Sie nach dem Öffnen der Bilder die folgende Befehlsfolge in ImageJ: Bild → Stapel → Bilder zum Stapeln.
11. Um das Verschiebungsfeld und die Traktion zu erhalten, verwenden Sie ImageJ-Plug-ins nach veröffentlichten Methoden. Codes und detaillierte Tutorials für diese Plugins finden Sie unter folgendem Link: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. Richten Sie die Bilder im Stapel mit dem Plugin "Template Matching" aus. Verwenden Sie die folgende Befehlsfolge in ImageJ, nachdem Sie den in Schritt 1.10 generierten Bildstapel geöffnet haben: Plugins → Template Matching → Align Slices in Stack → OK. Speichern Sie den Bildstapel anschließend. Verwenden Sie diesen neuen Image-Stack in den folgenden Schritten.
    2. Ermitteln Sie das Verschiebungsfeld mit dem PIV-Plugin (Particle Image Velocimetry) (Abbildung 2D). Verwenden Sie die folgende Befehlsreihenfolge, nachdem Sie den in Schritt 1.11.1 gespeicherten Bildstapel geöffnet haben: Plugins → PIV → Iteratives PIV (Basic) → OK → Akzeptieren Sie dieses PIV und geben Sie → OK aus. Speichern Sie die PIV-Ausgabe im selben Verzeichnis wie im ursprünglichen Bildstapel. Verwenden Sie dies als Eingabe im nächsten Schritt.
    3. Verwenden Sie abschließend das FTTC-Plugin (Fourier-Transform-Traktionszytometrie), um die Traktionskarte zu erhalten (Abbildung 2E). Verwenden Sie die folgende Befehlsreihenfolge: Plugins → FTTC → Materialeigenschaften einfügen, d.h. Elastizitätsmodul und Poisson-Verhältnis von PA-Gel → OK → Wählen Sie die in Schritt 1.11.2 gespeicherte PIV-Ausgabedatei → OK aus. Speichern Sie die FTTC-Ergebnisse im selben Verzeichnis wie im Bildstapel und in der PIV-Ausgabe.

Results

Abbildung 1. Erfolgreiche primäre humane Dickdarmzellkultur (sowohl Krebs als auch normal) auf verschiedenen Steifigkeitsgelen und auf Polystyrolschale. Phasenkontrastbilder zeigen die typische Morphologie von (A) Tumorzellen und (B) normalen Zellen auf unterschiedlichen Steifigkeitssubstraten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pbs	Lonza	17-516F
Trypsin	Worthington	LS003736
Acrylamid	Sigma-Aldrich	Nr. A4058
N-Methylenbisacrylamid (bis)	Sigma-Aldrich	Nr. M1533
Humanes Fibronektin	BD Biowissenschaften	354008
0,1 μm fluoreszierende Kügelchen	Lebenstechnologien	Nr. F8801
0,25 % Trypsin-EDTA	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 25200-056
12 mm2 Glas-Deckgläser	Corning	Nr. 2865-12