Zytoskelett und fokaler Adhäsionsorganisationsassay: Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Untersuchung der Zelladhäsion und -ausbreitung auf Substraten

>1. Immunfluoreszenzmikroskopie-Assays

1. Nehmen Sie die Substrate mit den Zellen, die immungefärbt werden sollen, auf die laminare Haube und entfernen Sie die Nährmedien.
2. Spülen Sie die Substrate mit PBS und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei RT.
3. Waschen Sie die Substrate dreimal (jeweils 5 Minuten) mit PBS. Inkubieren Sie die Substrate daher 30 min lang mit 500 μl Signalverstärker und spülen Sie sie mit PBS.
4. Inkubieren Sie Zellen mit dem monoklonalen Anti-Vinculin-Antikörper in einer Verdünnung von 1:250 in PBS für 45 min bei RT. Waschen Sie dann die Substrate 3 Mal (jeweils 5 Minuten) mit PBS.
5. Inkubieren Sie die Proben mit dem Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG bei einer Verdünnung von 1:200 in PBS bei RT für 30 Minuten. Waschen Sie die Substrate 3 Mal (jeweils 5 Minuten) mit PBS.
6. Um die F-Aktin-Struktur sichtbar zu machen, inkubieren Sie Zellen mit TRITC-Phalloidin-Konjugaten in einer Konzentration von 50 μg/ml für 45 min bei RT. Waschen Sie dann die Substrate 3 Mal (jeweils 5 Minuten) mit PBS.
7. Nehmen Sie die Proben mit einem konfokalen Scanning-Lasermikroskop auf (Abbildung 1A-1D).

Abbildung 1. Immunfluoreszenzfärbung von F-Aktin und Vinculin auf weichen Gel- und harten Polystyrolsubstraten.In der weniger verbreiteten (A1) Tumorzelle oder (A2) normalen Zelle auf weichen 2 kPa Gelen war keine Aktinfaser vorhanden. Auf weichen Gelen (B1-B2) sind jedoch punktuelle Vinculin-haltige fokale Adhäsionen vorhanden. Umgekehrt zeigen Primärzellen eine gut gespreizte Morphologie, gut definierte Aktin-Stressfasern (C1-C2) und diskrete längliche fokale Adhäsionen (D1-D2) auf starren Polystyrolsubstraten.