Zytoskelett und fokaler Adhäsionsorganisationsassay: Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Untersuchung der Zelladhäsion und -ausbreitung auf Substraten

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Ali, M. Y et al., Isolierung von primären humanen Dickdarmtumorzellen aus chirurgischem Gewebe und Kultivierung direkt auf weichen, elastischen Substraten für die Traktionszytometrie. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video beschreibt die Technik zur Untersuchung des Zytoskeletts und der fokalen Adhäsionen in primären menschlichen Dickdarmkrebszellen, um seine Variationen in Abhängigkeit von der Substratsteifigkeit zu verstehen. Diese Kultur von Krebszellen auf weichen und harten Substraten ermöglicht verschiedene nachgelagerte biophysikalische Messungen zur Krebsprognose.

Protokoll

>1. Immunfluoreszenzmikroskopie-Assays

Nehmen Sie die Substrate mit den Zellen, die immungefärbt werden sollen, auf die laminare Haube und entfernen Sie die Nährmedien.
Spülen Sie die Substrate mit PBS und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei RT.
Waschen Sie die Substrate dreimal (jeweils 5 Minuten) mit PBS. Inkubieren Sie die Substrate daher 30 min lang mit 500 μl Signalverstärker und spülen Sie sie mit PBS.
Inkubieren Sie Zellen mit dem monoklonalen Anti-Vinculin-Antikörper in einer Verdünnung von 1:250 in PBS für 45 min bei RT. Waschen Sie dann die Substrate 3 Mal (jeweils 5 Minuten) mit PBS.
Inkubieren Sie die Proben mit dem Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG bei einer Verdünnung von 1:200 in PBS bei RT für 30 Minuten. Waschen Sie die Substrate 3 Mal (jeweils 5 Minuten) mit PBS.
Um die F-Aktin-Struktur sichtbar zu machen, inkubieren Sie Zellen mit TRITC-Phalloidin-Konjugaten in einer Konzentration von 50 μg/ml für 45 min bei RT. Waschen Sie dann die Substrate 3 Mal (jeweils 5 Minuten) mit PBS.
Nehmen Sie die Proben mit einem konfokalen Scanning-Lasermikroskop auf (Abbildung 1A-1D).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

figure-results-1
Abbildung 1. Immunfluoreszenzfärbung von F-Aktin und Vinculin auf weichen Gel- und harten Polystyrolsubstraten.In der weniger verbreiteten (A1) Tumorzelle oder (A2) normalen Zelle auf weichen 2 kPa Gelen war keine Aktinfaser vorhanden. Auf weichen Gelen (B1-B2) sind jedoch punktuelle Vinculin-haltige fokale Adhäsionen vorhanden.