Vorbereitung von gefrorenen Hautgewebeblöcken: Ein Protokoll zur Konservierung von kutanen Melanomproben aus der Rückenhaut von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Moon, H., et al. Räumliche und zeitliche Kontrolle der Initiation von melanomartigen Melanozyten aus mutierten Melanozyten-Stammzellen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video beschreibt das detaillierte Protokoll für die Isolierung melanomhaltiger muriner Rückenhaut, gefolgt von der Kryo-Einbettung zur Vorbereitung eines gefrorenen Hautgewebeblocks. Der in Kryo eingebettete Gewebeblock kann geschnitten und mikroskopisch untersucht werden, um das Fortschreiten des Melanoms zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Gewebeverarbeitung

1. Isolierung der Haut
   1. Besorgen Sie sich vor dem Start folgende Medikamente: Autopsieinstrumente, Filterpapier und Papiertücher.
   2. Euthanasieren Sie die Mäuse gemäß den genehmigten Protokollen und bestätigen Sie den Tod, bevor Sie fortfahren.
   3. Rasieren Sie mit einem Haarschneider alle Haare aus dem Bereich der dorsalen Haut. Bürsten Sie den Bereich leicht mit einem fusselfreien Tuch ab, um den Bereich zu reinigen.
   4. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer scharfen Schere direkt über dem Schwanzansatz.
   5. Führen Sie eine große, stumpfe Schere in den Schnitt ein und trennen Sie das subdermale Bindegewebe.
   6. Isolieren Sie die interessierende Hautregion vorsichtig, indem Sie mit einer scharfen Schere am Rand des Gewebes entlang schneiden.
   7. Legen Sie das Hauttuch auf ein sauberes Papiertuch und dehnen Sie die Haut mit einer stumpfen Pinzette, so dass sie am Handtuch haftet und straff ist. Dieser Schritt dient dazu, das Gewebe zusätzlich zu stützen, so dass es unter Beibehaltung seiner Form manipuliert und verarbeitet werden kann.
      Anmerkung: Achten Sie darauf, nur die äußeren Bereiche des Hautgewebes zu berühren, da die Pinzette Hautschäden verursachen kann, die histologisch sichtbar sind.
2. Fixierung des Gewebes
   1. Falten Sie ein Stück Filterpapier in der Mitte und beschriften Sie es entsprechend. Legen Sie die Haut zusammen mit dem Papiertuch in das gefaltete Papier direkt neben der Falte und stellen Sie sicher, dass die Probe glatt und nicht gefaltet oder zerknüllt ist. Versiegeln Sie das Filterpapier, indem Sie die offenen Seiten heften, und schneiden Sie es dann so ab, dass das restliche Papier für zukünftige Proben verwendet werden kann.
      Anmerkung: Dieser Schritt wird so durchgeführt, dass die Haut während der Fixierung ihre Form behält.
   2. Tauchen Sie die Gewebeprobe 3 bis 5 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C vollständig in 10 % neutral gepuffertes Formalin.
   3. Nach der Fixierung die Proben aus dem Formalin nehmen, in entionisiertem Wasser waschen (je 2x 5 min) und mit der Herstellung von Gewebeblöcken fortfahren. Entfernen Sie vorsichtig alle Materialreste (z. B. Papierreste) aus dem Hautgewebe.
3. Herstellung von gefrorenen Gewebeblöcken (Abbildung 1)
   1. Schneiden Sie die Ränder der Hautprobe so ab, dass sie nicht gezackt sind, und machen Sie dann 3 sagittale Schnitte. Die Breite dieser Streifen sollte nicht größer als die Höhe des Kryomolds (5 mm) sein. Machen Sie dann Querschnitte, um Hautstücke zu erhalten, die nicht länger als die Breite des Kryomolds (20 mm) sind und eingebettet werden können. Wiederholen Sie den Vorgang mit der restlichen Hälfte der Rückenhaut oder bewahren Sie das Gewebe für andere Zwecke auf (alternativ die Hälfte vor der Fixierung aufbewahren).
      Anmerkung: Es ist wichtig, die Hautstücke in der richtigen Ausrichtung zu halten.
   2. Richten Sie das Kryomold (25 x 20 x 5 mm3) im Hochformat aus und legen Sie 4 bis 5 Hautstücke auf das OCT. Sobald alle Stücke an Ort und Stelle sind, verwenden Sie 2 Paar feine Pinzetten, um den langen Rand der Haut an den Boden der Kryoform zu bringen. Die Haut sollte nun im OCT senkrecht zum Boden der Form stehen. Achten Sie bei diesem Schritt darauf, die Bildung von Lufteinschlüssen innerhalb des OCT zu minimieren (Abbildung 1).
   3. Füllen Sie die Form bis zur zweiten Lippe mit OCT und legen Sie sie auf die flache Oberfläche aus Trockeneis. Verwenden Sie eine Pinzette, um alle Hautstücke anzupassen, die sich während des Transfers verschoben haben könnten, wenn der Block zu gefrieren beginnt. Sobald die untere Schicht verfestigt ist, ist eine Manipulation des Gewebes unmöglich.
   4. Schneiden Sie Objektträger von 8-10 μm für die Analyse.
4. Herstellung von Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeblöcken
   1. Legen Sie 2 Stücke fixierte Haut in eine beschriftete Kassette und dehydrieren Sie in steigenden Konzentrationen von Ethanol (75% Ethanol für 30 min, 85% für 30 min, 90% für 30 min, 95% für 30 min, 100% für 2x 30 min, Xylol oder Xylolersatz für 2x 30 min). Inkubieren Sie mit Paraffin bei 58-60° C, zuerst 30 Minuten und dann über Nacht.
   2. Das Gewebe in eine 24 x 24 mm² große Tissueform aus Edelstahl mit flüssigem Paraffin einbetten und bei -5 °C verfestigen. Die Gewebeorientierung sollte ähnlich wie bei gefrorenen Gewebeblöcken sein, damit Längsschnitte über mehrere Haarfollikel sichtbar gemacht werden können (Abbildung 1).
   3. Sobald das Paraffin erstarrt ist, entfernen Sie die Form und schneiden Sie sie für die Analyse in 5-10 μm große Abschnitte.

Ergebnisse

Abbildung 1: Isolierung von Hautgewebe und Kryo-Einbettung. Nach der Euthanasie wird die interessierende dorsale Hautregion der Maus rasiert und die Haut in ein Kryomold mit OCT eingebettet. Die gepunktete Linie auf der Maus stellt die Mittellinie dar. Typischerweise können 3 oder 4 Hautstücke isoliert werden, wobei das Liniensegment 3-4 entlang der Mittellinie verläuft; Ein solches Stück wird dur...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tierhaarschneider	Wahl	Tel.: 09990-502
Creme zur Haarentfernung	Nair	n/a	Erhältlich in den meisten Drogerien
Wattestäbchen	verschieden
UV-Glühbirne	UVP	Artikel-Nr.: 95-0042-08	Modell XX-15M Midrange-UV-Lampe
200 Proof Ethanol	verschieden		Reines Ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	Paraffin-Pellets
Neutral gepuffertes Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Taschentuch-Kassette	Sakura	Tel.: 89199-430	für FFPE-Verarbeitung
Kryoformen	Sakura	Artikel-Nr.: 4557	25 x 20 mm
FFPE-Metallform	Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Isofluran	verschieden		Veterinärtauglichkeit
Anästhesie-Inhalationssystem	verschieden		Veterinärtauglichkeit
Feine Schere	FST	Nr. 14085-09	Gerade, scharf/scharf
Feine Schere	FST	Artikel-Nr.: 14558-09	Gerade, scharf/scharf
Pinzette	FST	Tel.: 11252-00	Dumont #5
Pinzette	FST	Nr. 11018-12	Mikro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten f/w	Jackson Labore	Artikel-Nr.: 13590
LSL-tdTomate	Jackson Labore	7914	AI14