Hanging Drop Method: Eine Technik zur Erzeugung von 3D-Melanom-Sphäroiden

Zusammenfassung

Quelle: Müller, I. et al., Ein 3D-Organotypisches Melanom-Sphäroid-Hautmodell. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video beschreibt die Technik zur Erzeugung dreidimensionaler Sphäroide mittels der Hanging Drop-Methode unter Verwendung von Melanomzellen. Das in vitro generierte dreidimensionale (3D) organotypische Melanom-Sphäroidmodell kann die in vivo Architektur des malignen Melanoms abbilden und Einblicke in intratumorale Wechselwirkungen geben.

Protokoll

>1. Erzeugung von 3D-Melanom-Sphäroiden mit der Hanging Drop-Methode

1. Kultivieren Sie Melanomzellen (z. B. 451-LU oder eine beliebige Melanomzelllinie von Interesse) gemäß allgemeinen Protokollen unter Verwendung eines RPMI, der 10 % FCS enthält.
   1. Um Melanom-Sphäroide ähnlicher Größe und Qualität zu erzeugen, waschen Sie die Melanomzellen in PBS, geben Sie 5 ml 1x Trypsin-EDTA in PBS zu den Zellen in einen T175-Zellkulturkolben und inkubieren Sie sie 3 - 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT). Neutralisieren Sie das Trypsin durch Zugabe von 5 ml RPMI/10% FCS. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min. Resuspendieren Sie das Zellpellet in RPMI/FCS bei einer Endkonzentration von 10.000 Zellen/ml, die durch Zählung in einem Hämozytometer bestimmt wird.
2. 40 x 25 μL (= 250 Zellen) der Zellsuspension mit einer elektronischen Multipipette auf die Innenfläche des Deckels einer sterilen, nicht klebenden Zellkulturschale (Ø 10 cm) aufsprühen. Drehen Sie mit einer schnellen, aber gleichmäßigen Bewegung den Deckel um und legen Sie ihn auf die jeweilige Zellkulturschale mit 5 mL PBS.
   1. Kultivieren Sie je nach verwendetem Zelltyp 10-14 Tage lang "hängende Tropfschalen" in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
      Anmerkung: Zellen aus der metastasierten Melanomwachstumsphase wachsen typischerweise schneller und bilden im hängenden Tropfen festere Sphäroide im Vergleich zu Melanomzellen, die aus der radialen Wachstumsphase oder der vertikalen Wachstumsphase stammen. Beobachten Sie zur individuellen Beurteilung das Sphäroidwachstum unter einem Fernglas oder unter einem Lichtmikroskop (4-fache Vergrößerung). In der Regel sind Sphäroide nach 48 h unter einem Fernglas oder unter einem Lichtmikroskop (4-fache Vergrößerung) nachweisbar. Nach 10-14 Tagen sind sie ohne Vergrößerungsgerät sichtbar.
3. Fünf Tage nach der ersten Tropfenschmierung fügen Sie jedem Tropfen 10 μl frisches RPMI/10 % FCS-Medium hinzu. Tauschen Sie anschließend jeden zweiten Tag 10 μl Medium aus. Der Einsatz eines elektronischen Spenders ist in diesem Schritt sehr hilfreich.
4. Je nach Zelltyp ernten Sie die Sphäroide nach 10-15 Tagen. Spülen Sie die Sphäroide vorsichtig vom Deckel der hängenden Tropfzellkulturschale mit PBS ab. Sammeln Sie 10-20 Sphäroide in einer sterilen, nicht klebenden Zellkulturschale. Überschüssiges PBS vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette entfernen.
   Anmerkung: Die Kultivierungsdauer hängt von der Tumorwachstumsphase der Melanomzellen ab, als sie ursprünglich gewonnen wurden, z. B. wachsen Sphäroide, die von 451-LU-Zellen abgeleitet sind, innerhalb von 12 Tagen nach der Kultivierung im hängenden Tropfen auf einen Durchmesser von etwa 500 μm.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
fötales Serumalbumin (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	10 % in das Zellkulturmedium geben
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X verdünnt in PBS
RPMI	Thermo Fisher Scientific	61870010	Für die Kultivierung von Melanomzelllinien