Generierung organotypischer Vollhautrekonstruktionen: Ein Verfahren zur Erstellung eines 3D-Hautmodells anhand menschlicher Hautproben

Zusammenfassung

Quelle: Müller, I. et al. Ein 3D Organotypisches Melanom Sphäroid Hautmodell. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video beschreibt das detaillierte Protokoll zur Erstellung von in vitro 3D-Organotyp-Hautrekonstruktionen zur Untersuchung des Melanomverlaufs. Dieses Hautmodell ahmt sowohl die Architektur als auch die multizelluläre Komplexität von Organen in vivo nach.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Isolierung von primären Keratinozyten aus der Epidermis

1. Waschen Sie das Epidermisgewebe mit PBS. Schneiden Sie die Epidermis in kleinere Stücke (1 mm²) und sammeln Sie sie in einem konischen 50-ml-Röhrchen. 10 mL 1x Trypsin-EDTA (auf 37 °C vorgeheizt) zugeben und 5 min in einem Wasserbad bei 37 °C inkubieren. Die Gewebesuspension alle 2 min vortexen.
2. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 1 ml fötalem Kälberserum (FCS). Resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer 10-ml-Kunststoffpipette 4 Minuten lang auf und ab pipettieren. Versuchen Sie, Blasen und Schaumbildung zu vermeiden.
3. Pipettieren Sie die Zellsuspension in ein Zellsieb (Porengröße 100 μm), geben Sie es auf ein frisches konisches 50-ml-Röhrchen und spülen Sie es 3x mit 5 mL PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2-6 ml Kulturmedium mit 1 % (v/v) Gentamycin. Bestimmen Sie die Zellzahl manuell, indem Sie die Zellen in einem Hämozytometer zählen und 6 x 10⁵ Zellen in einen T75-Zellkulturkolben aussäen.

>2. Isolierung von primären Fibroblasten aus der Dermis

1. Schneiden Sie das Hautgewebe in kleinere Stücke (1 mm²) und geben Sie diese in ein konisches 50-ml-Röhrchen. 10 mL Kollagenase-Lösung (5 U/mL in PBS⁺) zugeben und 45 min in einem Wasserbad bei 37 °C inkubieren. Die Mischung aus Gewebestücken und Zellen bei 200 x g für 5 min zentrifugieren.
2. Waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 10 mL DMEM mit 4,5 g/L Glukose und L-Glutamin, jedoch ohne L-Pyruvat. Zum Schluss resuspendieren Sie die Gewebestücke in 2 ml DMEM, die 1 % (v/v) Gentamycin und 10 % FCS enthalten. In einen T25-Zellkulturkolben überführen und über Nacht in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
   HINWEIS: Das geringe Volumen ermöglicht es den Fibroblasten, aus den Gewebetrümmern zu wandern und zwingt sie, sich an den Kulturkolben zu heften.
3. Am nächsten Morgen weitere 6 ml DMEM/Gentamycin/FCS zugeben und 2-3 Tage bei 37 °C inkubieren, bis die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreicht haben.

>3. Erzeugung des dermalen Kompartiments organotypischer Vollhautrekonstruktionen

1. Generieren Sie Hautmodelle mit mikroporösen 24-Well-Zellmembraneinsätzen (Porengröße 8 μm), die in 24-Well-Platten platziert sind.
   Anmerkung: Achten Sie darauf, keine hängenden, sondern stehenden Einsätze zu verwenden, da diese zu einem späteren Zeitpunkt für die Luft-Flüssig-Kultivierung in eine 6-Well-Platte eingelegt werden.
2. Bereiten Sie die Gelneutralisationslösung (GNL) sowie die als MM bezeichneten Nährmedien und endothelialen Wachstumsmedien (EGM) vor. Um eine Gerinnung zu verhindern, lagern Sie das Kollagen Typ I (normalerweise aus Rattenschwanz, 3,5-4 mg/ml in 0,02 N Essigsäure) bis zur Verwendung auf Eis, da es bei RT zu gelieren beginnt.
3. Re-Suspendieren Sie 1 x 10⁵ Fibroblasten pro Insert in GNL und mischen Sie die Zellsuspension schnell mit Kollagen im Verhältnis 1:3 in einem Endvolumen von 500 μL/Insert. Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden, da Blasen die Qualität der Hautrekonstruktion beeinträchtigen können.
4. Lassen Sie die einzelnen Hautgele absetzen, indem Sie sie ohne Medium 30 Minuten lang bei RT in einer sterilen Haube aufbewahren. Anschließend jedes Gel mit DMEM bedecken, das 4,5 g/l Glukose, 1 % L-Glutamin, 10 % FCS und ohne L-Pyruvat enthält, und über Nacht bei 37 °C inkubieren.

>4. Erzeugung des epidermalen Kompartiments organotypischer Vollhautrekonstruktionen

1. Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium aus den Hautgelen und äquilibrieren Sie sie 2 Stunden lang bei 37 °C mit EGM-Medien (10 % FCS, 1 % PenStrep, 10 mg/ml Gentamicin). Entnehmen Sie das Medium und säen Sie vorsichtig 1 x 10⁵ in 100 μl EGM resuspendierte Keratinozyten auf das Hautgel aus.
2. Die Rekonstruktionen werden 1,5 h bei 37 °C inkubiert, damit die Keratinozyten am Hautkompartiment haften können.
   Anmerkung: Während dieser Inkubationszeit beginnen die Gele aufgrund der Fibroblasten-induzierten Kontraktion zu schrumpfen und lösen sich somit zumindest teilweise von den Einsatzwänden.
3. Decken Sie die Hautäquivalente mit ca. 800 μl EGM ab und entfernen Sie das restliche Gel vorsichtig mit einer kleinen (weißen) Pipettenspitze von der Einsatzwand. Kultivieren Sie die in EGM getauchten Hautäquivalente 7 Tage lang in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
   Anmerkung: Während dieser Zeit schrumpfen die Hautäquivalente erheblich.

>5. Luft-Flüssig-Kultivierung von organotypischen Vollhautrekonstruktionen

1. Übertragen Sie jeden Einsatz an Tag 8 in eine einzelne Vertiefung einer 6-Well-Platte. Geben Sie nur 1,2-1,4 mL MM-Medium in jede Vertiefung, so dass die Hautrekonstruktion vom Boden der Vertiefung mit Medium versorgt wird, aber nicht mit dem Medium bedeckt ist.
   Anmerkung: Die Kultivierung an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit ermöglicht die Schichtung des epidermalen Teils und die Etablierung einer vollständigen verhornten Schicht (Stratum corneum).
2. Wechseln Sie in den nächsten 10-17 Tagen jeden zweiten Tag das Medium, wie in Abschnitt 5.1 beschrieben. Fügen Sie während dieser Zeit dem Medium nach Bedarf Medikamente oder andere Reize hinzu. Entfernen Sie vorsichtig die vollständige Hautrekonstruktion mit einer gebogenen Pinzette aus dem mikroporösen Membraneinsatz für weitere Analysen, z. B. immunhistochemische Analysen (Abbildung 1).

Ergebnisse

Abbildung 1: Kultivierung von 3D-organotypischen Hautrekonstruktionen unter Wasser und an der Luft-Flüssig-Grenzfläche. An Tag 0 werden primäre Keratinozyten auf das Hautkompartiment ausgesät, das aus primären Fibroblasten besteht, die in eine Kollagen-Typ-I-Matrix eingebettet sind. 3D-Hautrekonstruktionen bleiben 7 Tage lang unter EGM kultiviert, lösen sich von der Einlegewand und beginnen zu sch...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
fötales Serumalbumin (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	10 % in das Zellkulturmedium geben
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X verdünnt in PBS
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	zur Kultivierung von primären Fibroblasten
Dispase	Gibco life Technologien	17105041	2U/ml, in PBS auflösen
Kollagen Typ I	BD Biowissenschaften	354249	Normalerweise sollte die Konzentration aus dem Rattenschwanz 3,5-4 mg/ml betragen
24-Well-Einsätze Nunclon	Nunc	140629	8 μm Porengröße; Verwendung von stehenden, nicht hängenden Einsätzen
Sieb für Zellen	BD Falke	Artikel-Nr.: 352360	gelb
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific	15750060	in PBS auflösen
Keralife Keratinzyt Medium	Zell-Systeme		Füge keine FCS oder Antibiotika hinzu
Kollagenase	SERVA	Artikel-Nr.: 17454	NB4 Standard-Sorte
juvenile humane Keratinozyten	Zell-Systeme	Nr. FC-0007	Alternative zum eigenen Präparat aus juveniler Vorhaut
juvenile humane Fibroblasten	Zell-Systeme	FC-0001	Alternative zum eigenen Präparat aus juveniler Vorhaut
EGF	Gibco life Technologien	Artikel-Nr.: 13247-051	Zugabe von 10 ng/ml nur für die Erzeugung von EGM-Medium
Calciumchlorid	Merck Chemie	Nr. 2381	zusätzlich 1,9 mM für die Erzeugung von EGM und 3,8 mM für MM-Medium
Selensäure	Alfa Aesar	Nr. 18851	add 53 nM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium
Insulin	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	Zugabe von 5 μg/ml zur Erzeugung von EGM- und MM-Medium
Ethanolamin	Sigma-Aldrich	E-0135	0,1 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium hinzufügen
P-Ethanolamin	Sigma-Aldrich	Nr. P-0503	0,1 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium hinzufügen
Holo-Transferrin	Sigma-Aldrich	Nr. T-0665	Zugabe von 5 μg/ml zur Erzeugung von EGM- und MM-Medium
Triiodthyronin	Sigma-Aldrich	Nr. T-6397	add 20 pM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	Nr. H-088816	Zugabe von 0,4 μg/ml für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium
Progesteron	Sigma-Aldrich	Tel. P-8783	10 nM nur für die Erzeugung von EGM-Medium hinzufügen
Hepes	Sigma-Aldrich	Nr. H-3784	add 15 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium
Serin	Sigma-Aldrich	Nr. S-4311	add 1 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium
Cholinchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. C-7017	0,64 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium hinzufügen
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Los 086K0361	2 % für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium
Adenin	Sigma-Aldrich	Nr. A-9795	0,18 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium hinzufügen
L-Glutamin	PromoCell	Nr. C-42209	add 7,25 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium
Strontiumchlorid	Sigma-Aldrich	255521	add 1 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium