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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von B16-BL6-Zellen
- Nehmen Sie die Zellkulturplatten aus dem 37-Grad-Inkubator und legen Sie sie in eine sterile Haube. Die Platten sollten zu etwa 70 % mit B16-BL6-Zellen des murinen Melanoms konfluent sein. Ein größerer Zusammenfluss kann das Metastasierungspotenzial der Zellen verändern.
- Fügen Sie 1 ml 0,05 % Trypsin-EDTA pro Platte hinzu, lassen Sie es 1 Minute einwirken und aspirieren Sie dann die Trypsin-Medienlösung.
- Geben Sie 1 ml Trypsin pro Platte und geben Sie die Platten für 10 Minuten in den Inkubator zurück.
- Nachdem Sie die Platten aus dem Inkubator in die sterile Haube gebracht haben, geben Sie 4 ml serumfreies Medium des Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) auf jede Platte.
- Entnehmen Sie die Zellen mit einer sterilen, motorisierten Pipette. Werfen Sie die Zellen gegen den Boden der Platte aus, wobei die Spitze in einem sehr leichten Winkel gedrückt wird, um die Zellen aufzubrechen. Wiederholen Sie dies mehrmals, um eine ausreichende Trennung der Zellklumpen zu gewährleisten, die sonst die Auswurfnadel verstopfen könnten. Auffangen und in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführen.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zelldichte zu bestimmen. Unter Beibehaltung der Gesamtzahl der B16-BL6-Zellen kann das Volumen des serumfreien RPMI bestimmt werden, das erforderlich ist, um Endkonzentrationen von 0, 0,065, 0,015, 0,25 und 0,5 Millionen Zellen/ml zu erreichen.
- Das Medium im 50-ml-Röhrchen wird gleichmäßig auf konische 15-ml-Röhrchen aliquotiert. Die konischen Röhrchen bei 2.250 x g 5 min zentrifugieren. Dekantieren Sie die Medien. Fügen Sie ein angemessenes Volumen an serumfreiem RPMI hinzu und bestätigen Sie die gewünschte Zelldichte per Hämozytometer. Passen Sie die Dichten an, indem Sie zusätzliche RPMI hinzufügen oder in einem kleineren Volumen entsprechend drehen und resuspendieren.
- Aliquotieren Sie 500 μl jeder Zellsuspension in markierte 1,8 ml-Röhrchen auf Eis.
>2. Schwanzvenen-Injektion
- Kaufen Sie weibliche C57BL/6 Mäuse (Alter 6-8 Wochen), 5 Mäuse pro Gruppe. Warten Sie einige Tage, bis sich die Mäuse daran gewöhnt haben.
- Nehmen Sie eine Maus, die am Schwanz gehalten wird, und führen Sie sie mit dem Hinterkopf voran in den Mausrückhaltebehälter. Ziehe die Maus mit dem Rumpf in der Hauptkammer des Rückhaltesystems und dem Schwanz nach außen, indem du die Maus zum Ende des Rückhaltesystems ziehst. Setzen Sie den Stößel ein und drücken Sie weiter, bis die Maus fest sitzt.
- Drehen Sie die Maus um 90 Grad, so dass eine der seitlichen Schwanzvenen nach oben zeigt. Reinigen Sie die Seite des Schwanzes der Maus mit einem Alkoholpad kräftig, insbesondere dort, wo die Schwanzvene am sichtbarsten ist.
Anmerkung: Eine gute Beleuchtung ist für eine effektive Visualisierung der Schwanzvenen bei B57BL/6J-Mäusen unerlässlich. Wärmelampen oder beheizte OP-Pads sind zwar nicht notwendig, helfen aber auch, indem sie das Volumen der Schwanzvene erhöhen.
- Sammeln Sie in einer sterilen Kulturhaube 300 μl Zellkulturmedium aus dem Röhrchen mit 2 Millionen Zellen/ml. Drehen Sie die Nadel um, indem Sie die Seite schnippen und den Kolben drücken, um Blasen aus der Spritze auszustoßen. Das Kultur-RPMI wird ausgestoßen, um ein Endvolumen von 250 μl zu erhalten.
- Strecken Sie den Mausschwanz mit der nicht-dominanten Hand aus. Halten Sie den Schwanz mit dem proximalen Ende des Schwanzes mit dem Zeigefinger der nicht dominanten Hand angehoben und den distalen Teil des Schwanzes mit dem Daumen nach unten gedrückt.
Anmerkung: Auf diese Weise wird die Schwanzvene in einer lateralen Position, parallel zur Rückhaltefläche, gehalten, wobei ein kongruenter Eintritt im distaleren Teil des Schwanzes möglich ist.
- Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene in Richtung des distalen Endes ein, zunächst in einem winzigen Winkel nach unten, und stellen Sie dann die Nadel so ein, dass sie dem Winkel der Schwanzvene beim weiteren Einführen entspricht (senken Sie das Kolbenende der Spritze relativ zur Nadel ab).
- Führen Sie die Nadel ca. 1 cm in die Schwanzvene ein. Beginnen Sie nach dem Einführen, den Kolben zu drücken, und halten Sie die Nadel ruhig.
Anmerkung: Befindet sich die Nadel in der Schwanzvene und ist das Ende der Nadel nicht verstopft, sollte das Medium ungehindert in die Vene fließen. Eine wirksame Injektion zeichnet sich durch die Blutclearance aus der Vene aus. Wenn es einen Widerstand gibt oder sich an der Injektionsstelle eine Blase zu bilden beginnt, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie es erneut an einer näheren Stelle entlang der Schwanzvene.
- Entfernen Sie die Nadel aus der Vene und entsorgen Sie sie. Halten Sie die Gaze gegen die Eintrittsstelle, um Blutungen zu stoppen.
- Entfernen Sie den Kolben aus dem Rückhaltesystem und legen Sie die Maus in den Empfängerkäfig.
- Für alle anderen Konzentrationen wiederholen.
Anmerkung: Die Etablierung von Lungenherden dauert ca. 2-3 Wochen, wobei die Variabilität je nach Zelllinie und gewünschter Größe der Herde erfolgt. In der Zwischenzeit sollten Mäuse auf Symptome überwacht werden, die eine frühzeitige Euthanasie rechtfertigen könnten, wie z. B. übermäßiges Hecheln.
>3. Zählen der Lungenherde
- Euthanasieren Sie die Maus, indem Sie sie in eine CO2 -Kammer legen und sie 5 Minuten lang 100 % CO2 aussetzen, das bei 10-30 % des Kammervolumens pro Minute eingebracht wird.
- Spreizen Sie die Maus auf Styropor. Erstellen Sie mit einer chirurgischen Schere einen chirurgischen Schnitt entlang des Brustbeins.
- Machen Sie zwei zusätzliche Schnitte, beide von der Oberseite des Brustbeinschnitts und verzweigt sich zu den Schultern der Maus, wodurch der Brustkorb freigelegt wird.
- Machen Sie zwei Schnitte, jeweils entlang der Seitenseiten des Brustbeins, um den Brustkorb vom Rumpf zu entfernen und die Lunge und das Herz freizulegen.
- Halten Sie das Herz mit einer chirurgischen Pinzette fest, durchtrennen Sie die Speiseröhre und die Luftröhre und befreien Sie Herz und Lunge von der Maus. Zur besseren Visualisierung unter ein Präpariermikroskop mit 10-facher Vergrößerung stellen.
- Präparieren Sie das Herz von der Lunge und entfernen Sie den Thymus, so dass nur die beiden Lungen übrig bleiben.
- Beginnen Sie mit der Lunge unter einem Präparierfernrohr mit der Zählung der Lungenherde. Jeder Herde sollte als kreisförmige, braune Vordringung auf der Oberfläche der Lunge erscheinen.
- Um die Konsistenz zwischen den Mäusen zu gewährleisten, zähle die Anzahl der Herde auf der Oberfläche eines Lappens und kehre dann diesen Lappen um. Wenn jeder der vier Lappen einzeln bearbeitet wird, kann das Zählen erleichtert werden.
- Bewahren Sie die Lunge auf und reparieren Sie sie, wenn Sie eine IHC durchführen, andernfalls entsorgen Sie die Überreste.