HCR-DNA FISH: Eine Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstechnik zum Nachweis viraler DNA in infizierten Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Wei Liu et al., Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).

In diesem Video wurden die mit MCPyV-Virionen infizierten Zellen einer in situ Hybridisierungskettenreaktion unterzogen, um MCPyV-spezifische Genome nachzuweisen. Darüber hinaus wurde die DNA-HCR-Technik mit FISH kombiniert, um die MCPyV-DNA in infizierten menschlichen Hautzellen sichtbar zu machen.

Protokoll

>1. Infektion

1. Pflegen Sie die primären humanen dermalen Fibroblasten in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % L-Glutamin. Bei Erreichen der Konfluenz spalten sich die Fibroblasten 1:4, ohne sich nach unten zu drehen.
   Anmerkung: Um die höchste Effizienz der MCPyV-Infektion zu erzielen, verwenden Sie primäre Fibroblasten zwischen den Passagen 5 und 12, die sich zum Zeitpunkt der Plattierung aktiv teilen.
2. Um menschliche dermale Fibroblasten zu infizieren, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS.
3. 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA in die Schale geben und bei 37 °C 5-10 min inkubieren.
4. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen von der Schale lösen.
5. Geben Sie 10 ml DMEM/F12-Medium mit 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF und 3 μM CHIR99021, die alle eine MCPyV-Infektion stimulieren, in die Schale und überführen Sie die Zelllösung in ein 15-ml-Röhrchen.
6. Schleudern Sie die Zellen 2 Minuten lang bei 180 x g herunter und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM/F12-Medium mit 20 ng/ml EGF, 20 ng/mL bFGF und 3μM CHIR99021 bei 2-4 x 10⁴ Zellen pro ml.
7. 200 μl der Zellsuspension, ergänzt mit 1 mg/ml Kollagenase Typ IV, in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte aussäen. MCPyV-Virionbestand auf Eis auftauen. Fügen Sie 10⁹ virale Genomäquivalente MCPyV-Virionen pro 1 μl Iodixanol für jeweils 2.500 bis 5.000 zu infizierende Zellen hinzu. Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte und legen Sie die Platte in den Inkubator.
8. Nach einer Inkubation bei 37 °C in 5 % CO₂ für 48-72 h werden 20 % FBS in jede Vertiefung gegeben.
9. Lassen Sie die Infektion bei 37 °C in 5 % CO₂ für 72-96 h weitergehen.

>2. In situ DNA-HCR

1. Fixieren Sie die auf Deckgläsern kultivierten Zellen mit 4 % PFA in PBS für 10 min. Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit PBS und behandeln Sie sie dann mit 70 % Ethanol, um die Zellen über Nacht bei 4 °C zu permeabilisieren.
   Anmerkung: Fixierte Proben können mehrere Tage in diesem Zustand verbleiben.
2. Prähybridisieren Sie die Proben, indem Sie Ethanol durch Sondenhybridisierungspuffer ersetzen und 60 Minuten lang bei RT inkubieren.
3. Die Sonde(n) (1 μM) (Tabelle 1) in einer Sonden-Hybridisierungspufferlösung bei einer Verdünnung von 1:500 Minuten 30 min vor dem Ende des Prähybridisierungsschritts verdünnen und bei 45 °C inkubieren.
4. Am Ende der Inkubationen pipettieren Sie ~10 μl der verdünnten Sondenmischung pro Deckglas auf Objektträger. Legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf die entsprechenden Tröpfchen der Hybridisierungssondenmischung. Versiegeln Sie die Ränder und Rückseiten der Deckgläser an den Objektträgern mit einer großzügigen Menge Gummizement.
5. Erhitzen Sie die Objektträger mit zusätzlichen Sonden 3 Minuten lang bei 94 °C, indem Sie die Objektträger auf die flache Seite eines Heizblocks setzen. Die Objektträger in eine befeuchtete Kammer geben und über Nacht bei 45 °C inkubieren. Um eine einfache Befeuchtungskammer herzustellen, befeuchten Sie sterile Papiertücher leicht mit dH₂O und legen Sie sie auf den Boden eines Kunststoffbehälters, der mit einer Gummidichtung verschlossen ist.
   Anmerkung: Beim Erhitzen kann der Gummizement kurz sprudeln. Achten Sie jedoch darauf, dass das Siegel nicht bricht.
6. Ziehen Sie den Gummizement vorsichtig mit einer Pinzette ab und legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach oben zurück in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit Sondenwaschpuffer bei RT.
7. Inkubieren Sie das Deckglas im Amplifikationspuffer (200 μl in 24-Well-Platten) bei RT für 30-60 Minuten.
8. In der Zwischenzeit glühen Sie jede der beiden markierten Oligonukleotid-Haarnadeln und erkennen die Sonden (Tabelle 1) in separaten PCR-Röhrchen, indem Sie 90 s lang auf 94 °C erhitzen und 30 Minuten lang auf RT abkühlen, während Sie vor Licht schützen. Mischen Sie die beiden Haarnadeln in Amplifikationspuffer, jeweils in einer Verdünnung von 1:50.
9. Stellen Sie eine Oberfläche für die Amplifikationsreaktion her, indem Sie Paraffinfilm über die offene Oberfläche eines 24-Well-Plattendeckels spannen. Pipettieren Sie 50-100 μl Tröpfchen des Hairpin/Amplifikationspuffer-Gemisches auf den Paraffinfilm für jedes Deckglas. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig aus der Vorverstärkerlösung zu entfernen. Trocknen Sie das Deckglas, indem Sie den Rand mit einem porösen Einwegtuch berühren, und legen Sie es mit der Zellseite nach unten auf das Amplifikationströpfchen.
10. Legen Sie den Plattendeckel mit den Deckgläsern in eine befeuchtete Kammer und inkubieren Sie ihn über Nacht bei RT im Dunkeln.
11. Bringen Sie die Deckgläser wieder in die Vertiefungen zurück. Inkubieren Sie die Proben mit 5x SSCT [5x Natriumchlorid-Natriumcitrat (SSC) 0,1% Tween 20, filtriert durch einen 0,22 μm Filter] mit 0,5 μg/mL DAPI für 1 h bei RT. Waschen Sie die Proben zweimal mit 5x SSCT bei RT.
12. Montieren Sie die Deckgläser auf Objektträger. Analysieren Sie die Zellen und bilden Sie die Proben mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop ab.

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Tabelle 1: In der Studie verwendete Sonden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Probe Hybridisierungspuffer	Molekulare Technologien
Sonden-Waschpuffer	Molekulare Technologien
Verstärkungspuffer	Molekulare Technologien
Alexa 594-beschriftete Haarnadeln	Molekulare Technologien	B4	Vor Licht schützen
Paraformaldehyd	Sigma	P6148