Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Isolierung von Keratinozyten aus der menschlichen Haut
- Beginnen Sie mit der Herstellung der folgenden Lösungen: 50 ml Lösung aus 0,25 % Trypsin und 0,1 % Glukose in DPBS. Mischen und filtrieren Sie die Lösung, sterilisieren Sie sie (0,2 μm). Bereiten Sie 10 ml RPMI-1640 + 2%ige FBS-Lösung, 50 ml DPBS und keratinozyten-serumfreies Medium (KSFM) vor. Fügen Sie KSFM-Ergänzungen und 250 μl Gentamycin zu 500 ml KSFM hinzu. Die Lösungen vor Gebrauch auf 37 °C vorwärmen.
- Sammeln Sie Haut von gesunden erwachsenen Freiwilligen, die sich einer plastischen Operation unterziehen. Die verwendeten Hautproben sind ca. 10 cm x 15 cm groß, können aber in der Größe variieren. Halten Sie die Haut während des Transports kühl, indem Sie die Hautproben in einer Styroporbox transportieren, die ein Kühlelement enthält. Bei Bedarf kann die Hautprobe über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
- Entfernen Sie das Fett unter der Hautpartie mit einer sterilisierten Schere, einem Skalpell und einer Pinzette.
- Den Hautabschnitt (ca. 10 cm x 15 cm) auf einer sterilen Abdeckung auf einer Platte mit Nadeln ausschnallen. Reinigen Sie die Haut zunächst mit einem trockenen, sterilisierten Mullkissen. Reinigen Sie dann die Haut mit einem sterilisierten Mullkissen mit 70 % Ethanol.
- Schneiden Sie mit einem Fußhobel die obere Schicht (Epidermis) des Hautabschnitts ab und legen Sie sie in eine 9 cm große Petrischale. Geben Sie dann sofort 25 ml der DPBS/Trypsin/Glukose-Lösung (hergestellt in Schritt 1.1) in die Petrischale. 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie mit einer Pipette die DPBS/Trypsin/Glukoselösung aus der Petrischale und fügen Sie 10 ml RPMI-1640 + 2% FBS hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren.
- Mit zwei Pinzetten geben Sie nun die Epidermiszellen in das Medium ab, indem Sie sowohl das epidermale als auch das dermale Kompartiment der Hautpartien sanft abkratzen und bewegen.
- Die epidermale Zellsuspension durch einen Metallfilter (1 mm Lochgröße) filtrieren und in einem 50-ml-Röhrchen auffangen. Die restlichen Hautabschnitte in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml RPMI-1640 ohne FBS geben und 10 s lang vortexen. Filtrieren Sie die Suspension durch den Metallfilter in ein 50-ml-Röhrchen, das die epidermale Zellsuspension enthält. Fügen Sie DPBS zu einem Gesamtvolumen von 50 ml hinzu.
- Die Zellsuspension wird 10 min lang bei 450 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das epidermale Zellpellet in ca. 10 ml 37 °C KSFM, abhängig von der Größe des Zellpellets. Zählen Sie die Zellen mit der Trypanblau-Färbemethode unter dem Mikroskop. Die Anzahl der Zellen, die aus einem 10 cm x 15 cm großen Hautschnitt gewonnen werden, beträgt ca. 50-100 x 106 Zellen. In jeden 75 cm2 Kulturkolben werden 8 x 106 Zellen zusammen mit 12 mL 37 °C KSFM überführt. Schütteln Sie die Kulturflaschen vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
- Inkubieren Sie die Keratinozyten in einem 37 °C heißen Inkubator mit 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium nach 2 Tagen und dreimal wöchentlich. Passagezellen, wenn die Kultur zu 70-80 % konfluent ist, was je nach Proliferationsrate der Keratinozyten etwa 2 Wochen dauert.
