Isolierung von Melanom-Stammzellen: Eine Methode zur Gewinnung von CD133-positiven und -negativen Melanomzellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Zusammenfassung

Quelle: Welte, Y. et al. von Patienten stammende Zellkultur und Isolierung von CD133+ putativen Krebsstammzellen aus Melanomen. J. Vis. Exp. (2013)

Dieses Video beschreibt die Technik zur Isolierung von CD133-negativen und positiven Melanom-Stammzellen aus einer primären Melanomzelllinie mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung. Die CD133-positiven Melanom-CSCs werden weiter untersucht, um die Mechanismen der Melanomtumorgenese zu verstehen.

Protokoll

>1. Magnetische Zellsortierung von CD133⁺ und CD133^- Melanomzellen mit LS-Säulen

1. Bereiten Sie einen MACS-Puffer vor, der 2 mM EDTA und 5 % FCS in PBS enthält. Mischen Sie durch Invertieren und Sterilfiltratpuffer mit einer 0,22 μm Steritop-GP Filtereinheit. Puffer auf 4-8 °C kühlen und vor Gebrauch entgasen.
2. Accutase, PBS und Quantum 263 medium auf 37 °C vorwärmen.
3. Waschen Sie 80% konfluente Zellen mit PBS. Fügen Sie eine angemessene Menge Accutase hinzu und inkubieren Sie, bis sich die Zellen von der Kulturoberfläche lösen. Sammeln Sie Zellen in einem 50-ml-Röhrchen mit dem Quantum 263 Medium.
4. Bestimmen Sie die Zellzahl und zentrifugieren Sie die benötigte Anzahl an Zellen für 5 min bei 300 x g und 4-8 °C. (Gemäß Miltenyi-Protokoll können maximal 2x 10⁹ Zellen pro LS-Säule geladen werden. Zelllinienspezifische optimale Zahlen sollten ermittelt werden und können deutlich niedriger sein.) Überstand vollständig ansaugen.
5. Resuspendieren Sie maximal 1x 10⁸ Zellen mit 350 μl MACS-Puffer (für höhere Zellzahlen skalieren Sie alle folgenden MACS-Puffer-, FcR-Blockierungsreagenz-, CD133/1-Biotin- und Anti-Biotin-MicroBeads-Volumina entsprechend hoch).
6. 100 μl FcR-Blockierungsreagenz hinzufügen.
7. 50 μl CD133/1-Biotin zugeben. Mit einem Wirbel gut mischen und bei 4-8 °C 10 min inkubieren.
8. Die Zellen werden durch Zugabe von 10 mL MACS-Puffer gewaschen und 5 min bei 300 x g und 4-8 °C zentrifugiert. Der Überstand wird vollständig abgesaugt.
9. Wiederholen Sie den Waschschritt (1.8).
10. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 400 μl MACS-Puffer.
11. Fügen Sie 100 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen hinzu. Mit einem Strudel gut mischen und bei 4-8 °C 15 min inkubieren.
12. Bereiten Sie in der Zwischenzeit den MACS-Separator für die magnetische Trennung vor. Befestigen Sie QuadroMACS an den MACS Separator Multi Stand. Setzen Sie die benötigte Anzahl an LS-Säulen mit den Säulenflügeln nach vorne in das Magnetfeld des QuadroMACS ein. Setzen Sie einen Vorabscheidungsfilter (mit 30 μm Nylonnetz) in jede LS-Säule und ein entsprechendes Sammelröhrchen (15 mL oder 50 mL) unter jede Säule ein. Bereiten Sie Filter und Säule vor, indem Sie mit 3 mL MACS-Puffer spülen. Durchfluss verwerfen.
13. Die Zellen werden durch Zugabe von 10 mL MACS-Puffer gewaschen und 5 min bei 300 x g und 4-8 °C zentrifugiert. Der Überstand wird vollständig abgesaugt.
14. Resuspendieren Sie die Zellen mit 500 μl MACS-Puffer und tragen Sie die Zellsuspension mit dem Vorseparationsfilter auf die LS-Säule auf.
15. Dreimal mit 3 mL MACS-Puffer pro Säule waschen. Fügen Sie den frischen Puffer nur hinzu, wenn das Säulenreservoir leer ist.
16. Das gesamte gesammelte Abwasser enthält die unmarkierte CD133-Zellfraktion.
17. Entsorgen Sie den Vorabscheidefilter, nehmen Sie die Säule aus dem Abscheider und stellen Sie sie auf ein geeignetes Auffangröhrchen.
18. Tragen Sie 5 mL MACS-Puffer auf. Spülen Sie die markierten CD133⁺-Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken.
19. Um die Reinheit der negativen Fraktion zu erhöhen, tragen Sie die Zellsuspension auf eine neue äquilibrierte LS-Säule auf, die in das QuadroMACS eingesetzt wird. Das Abwasser enthält die CD133-Fraktion.
20. Verwerfen Sie die Spalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Accutase	PAA Laboratories GmbH	Nr. L11-007
Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dehydrat (EDTA)	Sigma-Aldrich, Inc.	Nr. E-7889
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	Tel.: 130-092-395
Indirektes CD133 Micro-Bead Kit Mensch	Miltenyi Biotec GmbH	Tel.: 130-091-895	Enthält: CD133/1(AC133)-Biotin, Anti-Biotin-Mikroperlen und FcR-Blockierungsreagenz
Quantum 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
MACS Separator Multi Stand	Miltenyi Biotec GmbH	Tel.: 130-042-303
MACS Trennsäulen 25 LS Säulen	Miltenyi Biotec GmbH	Tel.: 130-042-401
QuadroMACS-Abscheider	Miltenyi Biotec GmbH	Tel.: 130-090-976