Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten
0 - bis 4 Tage alte männliche und/oder weibliche C57Bl/6J-Welpen werden durch Enthauptung eingeschläfert und die Extremitäten der euthanasierten Mäuse mit einer chirurgischen Schere entfernt.
- Rollen Sie den Rüssel jeder Maus in einem Laminar-Flow-Schrank kurz in eine sterile Petrischale, die 70 % Ethanol enthält. Nehmen Sie den Rüssel aus dem Ethanol und legen Sie ihn in eine leere, sterile Petrischale.
- Machen Sie mit einer chirurgischen Schere, die in 70% Ethanol sterilisiert ist, einen Schnitt in die Haut auf der ventralen Seite des Rumpfes, beginnend vom Hals bis zum Schwanz. Schälen Sie die Haut mit einer sterilen Pinzette vom Rüssel der Maus.
- Legen Sie die Haut mit der Dermisseite nach unten in eine 6-Well-Schale mit 3 ml 1x Antibiotikum/Antimykotischer Lösung und inkubieren Sie sie 2-3 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Schalten Sie den Gewebe-Chopper mit den folgenden Einstellungen ein: Dicke der Schnitte: 1 μm; Blattkraft: ~60% des Maximums; Geschwindigkeit: ~50% des Maximums.
- Übertragen Sie die Haut mit der Dermisseite nach unten auf eine sterile Gewebe-Chopper-Scheibe und führen Sie die Haut 3 Mal vollständig durch den aktivierten Gewebe-Chopper.
- Übertragen Sie die homogenisierte Haut in ein steriles, konisches 15-ml-Röhrchen mit 3 ml Hautverdauungspuffer (bereiten Sie 3 ml frischen Hautverdauungspuffer vor, der 10 % fötales Rinderserum, 1 % Penicillin/Streptomycin-Lösung, 1 % L-Glutamin, 10 mg/ml Kollagenase Typ I, 0,25 % Schweinetrypsin und 0,02 mg/ml Desoxyribonuklease I in RPMI 1640 enthält). Mischen Sie die resultierende Suspension, indem Sie 10-15 Mal mit einer P1000-Mikropipette auf und ab pipettieren.
- Verschließen Sie das konische Röhrchen und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang in einem 37 °C heißen Wasserbad, wobei Sie das Röhrchen alle 3-5 Minuten umdrehen.
- Pelletieren Sie die Zellen im Hauthomogenat, indem Sie das konische Röhrchen in einem schwingenden Schaufelrotor bei 750 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Entfernen Sie mit einer P1000-Mikropipette langsam und vollständig den Hautverdauungspuffer und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
Anmerkung: Ein Teil der ganzen Haut kann in diesem Stadium gerettet und als Kontrolle zur Bestätigung der zellulären Reinheit verwendet werden. Diese Zellen werden durch ein 70 μm Zellsieb abgeseiht und weiter verarbeitet.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet gründlich in 1 ml Melanozytenmedium, indem Sie mit einer P1000-Mikropipette 15-20 Mal auf und ab pipettieren. Geben Sie die resultierende Zelllösung tropfenweise in eine unbeschichtete Vertiefung einer 6-Well-Schale, die 1 ml Melanozytenmedium enthält.
- Das plattierte Hauthomogenat wird in einen Gewebekultur-Inkubator gegeben, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist. Lassen Sie die Kulturen 40 Min. inkubieren< />
Anmerkung: Während dieser Zeit haften einige Fibroblasten im Hauthomogenat an der unbeschichteten Schale, während die Melanozyten und Keratinozyten in Suspension bleiben.
- Übertragen Sie den Kulturüberstand aus der unbeschichteten Schale in eine Vertiefung einer vorgewaschenen, mit Kollagen beschichteten 6-Well-Schale. G418 wird so in das Medium gegeben, dass die Endkonzentration 100 ng/ml beträgt.
- Geben Sie 2 ml Fibroblastenmedium in eine Vertiefung der unbeschichteten Schale, die jetzt adhärente Fibroblasten enthält.
- Inkubieren Sie beide Kulturen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist.
- Aspirieren Sie das Medium und alle Rückstände aus jeder Kultur separat 16-24 Stunden nach dem Plattieren. Waschen Sie jede Schale zweimal mit 1 ml sterilem PBS und fügen Sie dann 2 ml frisches Melanozytenmedium plus 100 ng/ml G418 in die Melanozytenkultur und 2 ml frisches Fibroblastenmedium in die Fibroblastenkultur hinzu. (Bereiten Sie 6 ml frisches Melanozytenmedium mit 10 % fötalem Rinderserum, 7 % Pferdeserum, 1 % Penicillin/Streptomycin-Lösung, 1 % L-Glutamin, 0,5 mM Dibutyrylcyclic AMP (dbcAMP), 20 nM Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) und 200 pM Choleratoxin (CT) in der Nährstoffmischung F-12 Ham's media vor.
HINWEIS: Konzentrierte dbcAMP-, TPA- und CT-Stammlösungen können hergestellt, aliquotiert und >1 Jahr bei -80 °C gelagert werden. Basismedien, denen diese Komponenten fehlen, können bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
Bereiten Sie 4 ml Fibroblastenmedium vor, das 10 % fötales Rinderserum, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium enthält. Dieses Medium kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden)
- Nachdem die Melanozytenkulturen 48 h lang mit G418 behandelt wurden, waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml sterilem PBS und fügen Sie der Kultur 2 ml frisches Melanozytenmedium ohne G418 hinzu.
Anmerkung: Da die Fibroblasten in der Melanozytenkultur nach der G418-Behandlung weiter absterben, spülen Sie das Geschirr mit sterilem PBS, um abgestorbene Zellen zu entfernen, und fügen Sie frisches Melanozytenmedium hinzu. Melanozyten- und Fibroblastenkulturen sollten durchgelassen werden, wenn sie eine Konfluenz von 70-80 % erreichen.
