Methodenartikel

Rekombinante Virionenpräparation des Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV): Eine Technik zur Herstellung von rekombinantem MCPyV-Virion mit hohem Titer

30. April 2023

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Wei Liu et al. Merkelzell-Polyomavirus-Infektion und -Nachweis, J. Vis. exp. (2019)

In diesem Video zeigen wir die Herstellung von Merkel-Zell-Polyomavirus- oder MCPyV-Virionen unter Verwendung von 273TT-Zellen. Diese Technologie hilft bei der Herstellung von Hochtitern der rekombinanten MCPyV-Virionen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

>1. Rekombinante MCPyV-Virionenvorbereitung

  1. 50 μg pR17b-Plasmid (tragendes MCPyV-Genom) mit 250 μg BamHI-HF in einem Volumen von 200 μl (4 h bei 37 °C) verdauen, um das virale Genom vom Vektorrückgrat zu trennen (Abbildung 1).
  2. Geben Sie 1200 μl Puffer PB (ergänzt mit 10 μl 3 M NaAc, pH 5,2) zur verdauten DNA und reinigen Sie über 2 Miniprep-Spin-Säulen (20 μg DNA-Kapazität). Eluieren Sie das verdaute pR17b-Plasmid aus jeder Säule mit 200 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH8,0, 1 mM EDTA).
  3. Bereiten Sie die Ligationsreaktion in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor. Fügen Sie 400 μl gereinigte Plasmid-DNA aus Schritt 1.2, 8,6 ml 1,05x T4-Ligasepuffer und 6 μl hochkonzentrierte T4-Ligase hinzu. Über Nacht bei 16 °C inkubieren.
  4. Geben Sie 45 mL Puffer PB (ergänzt mit 10 μl 3 M NaAc, pH 5,2) in die Ligation und laden Sie mit einem Vakuumverteiler durch 2 Miniprep-Spin-Säulen. Eluieren Sie jede Säule mit 50 μl TE-Puffer. Rechnen Sie mit einer Ausbeute von etwa 30 μg DNA.
  5. Am späten Nachmittag/Abend 6 x 106 293TT Zellen in eine 10 cm große Schale säen, die DMEM-Medium enthält, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % L-Glutamin ohne Hygromycin B.
  6. Stellen Sie am nächsten Morgen sicher, dass die Zellen zu etwa 50 % zusammenfließen. Transfektieren Sie mit 66 μl Transfektionsreagenz (1,1 μl/cm2), 12 μg religierter MCPyV-Isolat R17b-DNA aus Schritt 1.4, 8,4 μg ST-Expressionsplasmid pMtB und 9,6 μg LT-Expressionsplasmid pADL.
  7. Wenn die transfizierten Zellen fast zusammenfließend sind, trypsinisieren Sie die Zellen am nächsten Tag und übertragen Sie sie zur weiteren Expansion in eine 15-cm-Schale.
  8. Optional kann eine kleine Anzahl von 293TT-Zellen nach der Expansion entnommen und eine ZF-Färbung für MCPyV LT (CM2B4) und VP1 (MCV VP1 Kaninchen) durchgeführt werden, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Zu diesem Zeitpunkt können nukleäre LT-Signale sichtbar sein, aber die VP1-Expression wird wahrscheinlich nicht nachweisbar sein.
  9. Wenn die 15-cm-Schale fast konfluent wird (normalerweise 5-6 Tage nach der ersten Transfektion), übertragen Sie die Zellen in drei 15-cm-Schalen. Ernten Sie die Zellen aus den 15-cm-Schalen, wenn sie fast konfluent sind, und befolgen Sie das untenstehende Virusernteprotokoll.
    Anmerkung: Führen Sie optional die Qualitätskontrolle IF durch, wie in Schritt 1.8 beschrieben. Die meisten Zellen sollten zu diesem Zeitpunkt sowohl MCPyV LT- als auch VP1-positiv sein.
  10. Um das Virus zu ernten, trypsinisieren Sie die Zellen, drehen Sie sich bei 180 x g für 5 min bei RT und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie ein Zellpellet Volumen DPBS-Mg hinzu (DPBS mit 9,5 mM MgCl2 und 1x Antibiotikum-Antimykotikum). Fügen Sie dann 25 mM Ammoniumsulfat (aus einer 1 M pH 9-Stammlösung) hinzu, gefolgt von 0,5 % Triton X-100 (aus einer 10 %igen Stammlösung), 0,1 % Benzonase und 0,1 % einer ATP-abhängigen DNase. Gut mischen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  11. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang auf Eis und fügen Sie dann 0,17 Volumen 5M NaCl hinzu. Mischen und weitere 15 min auf Eis inkubieren. 10 min bei 12.000 x g in einer 4 °C Zentrifuge schleudern. Wenn der Überstand nicht klar ist, drehen Sie das Rohr vorsichtig um und wiederholen Sie den Schleuderschritt. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen.
  12. Das Pellet wird mit einem Volumen DPBS, das mit 0,8 M NaCl ergänzt wird, resuspendiert und erneut geschleudert, wie in Schritt 1.11 beschrieben.
  13. Kombinieren Sie die Überstände aus Schritt 1.11 und 1.12 und drehen Sie sie noch einmal wie in Schritt 1.11 beschrieben.
  14. Gießen Sie Gradienten von Iodixanol in dünnwandige 5-ml-Polyallomerröhrchen, indem Sie ~0,7 ml-Schritte (27 %, dann 33 %, dann 39 %) mit einer 3-ml-Spritze mit einer langen Nadel oder einer p1000-Pipette unterlegen (27 %, dann 33 %, dann 39 %).
  15. 3 ml des geklärten virushaltigen Überstands auf den vorbereiteten Iodixanol-Gradienten laden.
  16. Schleudern Sie 3,5 h lang bei 234.000 x g und 16 °C in einem SW55ti-Rotor. Stellen Sie die Beschleunigung und Verzögerung auf langsam.
  17. Nach der Ultrazentrifugation 12 Fraktionen in silikonisierten Röhrchen sammeln (jede Fraktion ist ~400 μL).
  18. Analysieren Sie die Fraktionen auf das Vorhandensein von Viren mittels dsDNA-Reagenz und/oder Western Blot für VP1 (MCV VP1 Kaninchen). Poolieren Sie Gradientenfraktionen mit maximalem dsDNA- und/oder VP1-Gehalt und charakterisieren Sie den Bestand durch quantitative PCR, um das virale Genomäquivalent zu berechnen. Lagern Sie den MCPyV-Virionbestand bei -80 °C.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Abbildung 1. Herstellung eines MCPyV-Virions unter Verwendung eines rekombinanten viralen Genoms.(A) Eine Plasmidkarte von pR17b (MCPyV-Genomplasmid). (B) Ein repräsentatives Bild einer MCPyV-Virionprobe, die über einen Gradienten entnommen und gereinigt wurde. Der Pfeil markiert das Band der MCPyV-Virionen, die im Kern des Gradienten konzentriert sind. (C...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM/F12 mittelThermo Fisher ScientificTel.: 11330-032
Rekombinantes humanes EGF-Protein, CFF&E-SystemeArtikel-Nr.: 236-EG-200Bei -80 Grad Celsius lagern
CHIR99021Kaiman-ChemieArtikel-Nr.: 13122Bei -80 Grad Celsius lagern
CHIR99021SigmaSML1046Bei -80 Grad Celsius lagern
Kollagenase Typ IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiotisch-AntimykotischThermo Fisher ScientificArtikel-Nr.: 15240-062Vor Licht schützen
DMEM-MediumThermo Fisher Scientific11965084
ParaformaldehydSigmaNr. P6148
Anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa CruzSC-136172Los # B2717
MCV VP1 KaninchenPolyklonales Kaninchenserum #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Transfektion des viralen GenomsZelllyseDNase BehandlungDichtegradientenzentrifugationIodixanol UltrazentrifugationGewinnung der Virionenfraktion293TT ZellkulturF rderung der viralen Replikation

Verwandte Artikel