Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung des transparenten Maushautgewebes
HINWEIS: Alle Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, hatten einen genetischen Hintergrund von C57BL/6
- Entnahme von Hautgewebe von Mäusen.
- Euthanasieren Sie die Mäuse auf humane Weise durch Gebärmutterhalsluxation.
- Entfernen Sie vorsichtig mit einem Trimmer Haare von der entsprechenden Hautstelle und achten Sie darauf, die Haut nicht zu verletzen.
- Waschen Sie die Haut zur Dekontamination mit 70% Ethanol in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Heben Sie die dorsale Halshaut mit einer Pinzette an und machen Sie einen Schnitt mit einer Schere.
- Präparieren Sie eine große Fläche der dorsalen Maushaut (ca. 1,5 x 4 cm).
- Die Haut mit der Dermisseite nach unten auf einem Filterpapier flach drücken und die anterior-hintere Ausrichtung der Probe notieren.
- Schneiden Sie das Filterpapier um die präparierte Haut herum und geben Sie es in ein 15-ml-Röhrchen, das mit frisch zubereiteter 4%iger Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in PBS gefüllt ist.
- 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank bei 4 °C fixieren.
- Waschen Sie die Haut 2x 5 min in PBS in einer 15 mL Tube.
Anmerkung: Die folgenden Schritte (1.1.10 - 1.1.12) sind optionale Schritte für die Langzeitlagerung von Gewebe.
- Dehydrieren Sie präparierte Haut in PBS mit steigender Ethanolkonzentration (25 %, 50 %, 70 %) in einem 15-ml-Röhrchen während 1-stündiger Waschschritte bei Raumtemperatur.
- Lagern Sie dehydrierte Haut in 70%igem Ethanol in PBS in einer 15-ml-Tube bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung.
- Vier Stunden vor der Reinigung rehydrieren Sie das Hautgewebe in PBS mit abnehmender Ethanolkonzentration (70 %, 50 %, 25 %, 0 %) in einem 15-ml-Röhrchen während 1-stündiger Waschschritte bei Raumtemperatur.
- Säuberung der Hautbiopsien der Maus
- Bereiten Sie die CUBIC1-Reinigungslösung vor, indem Sie 3,85 g Harnstoff und 3,85 g N,N,N',N'-Tetrakis (2-Hydroxypropyl)-Ethylendiamin in 5,38 mL destilliertem Wasser auf einer auf 60-70 °C eingestellten Heizung auflösen. Verwenden Sie einen Heißrührer.
- 2,31 g Polyethylenglykolmono-p-isooctylphenylether/Triton X-100 werden der Lösung zugesetzt, sobald sie klar ist und auf Raumtemperatur abgekühlt ist.
- Schneiden Sie die Maushaut mit einer scharfen Rasierklinge in Biopsien von ungefähr 0,2 x 0,5 cm und tauchen Sie sie in 5 mL CUBIC1 Reinigungslösung in ein 15 mL Röhrchen. Um die Visualisierung der Haarfollikel zu optimieren, stellen Sie sicher, dass die längere Seite der Biopsie entlang der antero-posterioren Richtung der Probe geschnitten wird.
- Auf einer rotierenden Plattform in einen Hybridisierungsofen bei 37 °C stellen.
- Wechseln Sie die Clearing-Lösung nach 7 Tagen. Bereiten Sie vor der Verwendung eine frische CUBIC1-Lösung vor.
- Überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes nach 7 Tagen. Falls erforderlich, lassen Sie die Biopsien in CUBIC1 Clearing-Lösung, bis das Gewebe vollständig transparent ist.
- Sobald die Hautbiopsie transparent ist, entfernen Sie die CUBIC1-Lösung und fügen Sie 4 ml 1x PBS hinzu, um das Gewebe 4 Mal für 6 Stunden bei 37 °C zu waschen.
- Waschen Sie das Hautgewebe in 20 % w/v Saccharose in PBS in einer 15 ml Tube für 4 Stunden bei 37 °C.
- Frieren Sie das Gewebe in einem Einbettmedium mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) in einem 15-ml-Röhrchen über Nacht in einem Gefrierschrank bei -80 °C ein.
Anmerkung: Dieser Schritt erhöht die Durchlässigkeit der Biopsie für die Penetration von Antikörpern in den nachfolgenden Schritten.
2. Immunfluoreszenz-Färbung
- Tauen Sie das Gewebe von (Schritt 1.2.9) für 2 - 3 Stunden auf Raumtemperatur auf.
- Waschen Sie das Tuch in der 15-ml-Tube mit 5 mL PBS für 8 Stunden bei Raumtemperatur, um die OCT-Verbindung zu entfernen.
- Übertragen Sie die Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen und inkubieren Sie das Gewebe in 1 ml Kaninchen-Anti-Keratin14- oder Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörper, beide 1:100 in PBST (PBS + 0,1 % Triton-X100) verdünnt für 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 °C-Ofen.
- Übertragen Sie die Biopsien in ein 15-ml-Röhrchen und waschen Sie das Gewebe 4 Mal für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 °C-Ofen.
- Übertragen Sie die Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, fügen Sie 1 ml Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper Alexa594 hinzu, verdünnt 1:100 in PBST, und inkubieren Sie sie 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 °C-Ofen.
- Übertragen Sie die Biopsien in ein 15-ml-Röhrchen und waschen Sie das Gewebe 4 Mal für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 °C-Ofen.
- Übertragen Sie die Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, fügen Sie 1 ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) nukleare Gegenfärbelösung (1:1.000) in PBST hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht auf einem Schüttler in einem 37 °C-Ofen.
- Entfernen Sie die DAPI-Gegenfärbelösung und geben Sie 1 ml PBST in das 2-ml-Röhrchen, um das Gewebe 4 Mal für 6 Stunden auf einem Shaker in einem 37 °C Ofen zu waschen.
Anmerkung: Optionaler Schritt: Biopsien können im Dunkeln in 1x PBS mit 0,02% Natriumazid für mindestens 3 Wochen gelagert werden.
>3. Bildgebung
- Bereiten Sie die CUBIC2-Clearing-Lösung vor, die 50 % (w/v) Saccharose, 25 % (w/v) Harnstoff, 10 % (w/v) 2,2',2'-Nitrilotriethanol und 0,1 % (v/v) Triton X-100 enthält.
- Inkubieren Sie das Hautgewebe in 1 mL CUBIC2-Lösung in einem 2 mL Röhrchen auf einem Schüttler für 24 Stunden in einem 37 °C Ofen. Dieser Schritt gleicht den Brechungsindex des Gewebes aus.
- Überprüfen Sie die Klarheit des Gewebes. Sobald sie klar ist, positionieren Sie die gesamte Hautbiopsie (0,2 x 0,5 cm) auf ihrer längeren Seite auf einem Glasdeckglas, so dass die Richtung der Länge der Haarfollikel parallel zur Deckglasoberfläche (#1 24 x 60 mm) verläuft.
Anmerkung: Optionaler Schritt: Antikörpergefärbte Biopsien können ca. 7 Tage in CUBIC2-Lösung gelagert werden. Mit Nilrot gefärbte Biopsien können nur bis zu 1 Tag in CUBIC2-Lösung gelagert werden und sollten so bald wie möglich abgebildet werden.
- Bereiten Sie die Bildgebungskammer vor (Abbildung 1).
HINWEIS: Verbrauchsmaterialien, die für die Vorbereitung der Bildgebungskammer benötigt werden, sind: blauer Reißnaps, Knetmasse oder ähnliches und 2 Deckgläser (24 x 50 mm) (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie zwei dünne Streifen blaues Klebring (Durchmesser ca. 1 mm x 2 cm) und zwei Deckgläser vor (Abbildung 1B).
- Legen Sie blaue Klebestreifen auf einen Deckglas, so dass genügend Platz für die Hautbiopsie bleibt (Abbildung 1C, Schritt 3.4.3).
- Legen Sie eine Hautbiopsie zwischen den Streifen auf das Deckglas in einen Tropfen CUBIC2-Lösung (Abbildung 1C).
- Decken Sie die Hautbiopsie mit dem zweiten Deckglas ab (Abbildung 1D).
- Platzieren Sie die Bildgebungskammer mit der montierten Hautbiopsie auf dem Tisch eines konfokalen Mikroskops und bewegen Sie das Gewebe in den Lichtweg.
- Scannen Sie die Probe mit einer Quecksilber- oder Halogenlichtquelle und Standard-Epifluoreszenzfiltern (z. B. DAPI/GFP/CY3/CY5), um fluoreszenzgefärbte Bereiche von Interesse zu identifizieren.
- Bildbereiche von Interesse mit einem 10X- und 20X-Objektiv (NA 0,75) und konfokalen Standard-Fluoreszenzbildgebungsverfahren (z. B. mit DAPI-gefärbten Proben, die mit einem 405-nm-Laser beleuchtet werden und ein Fluoreszenzsignal zwischen 425 und 475 nm sammeln, und mit Alexa Fluor 594- oder Nilrot-gefärbten Proben, die mit einem 561-nm-Laser beleuchtet werden und ein Fluoreszenzsignal zwischen 570 und 620 nm sammeln).
- Generieren Sie Bild-Z-Stapel für jeden interessierenden Bereich mit der Z-Stapel-Bilderfassungssoftware des Mikroskops (z. B. mit der NIS-Elemente-Bildgebungssoftware 4.13, wie unten beschrieben).
- Stellen Sie eine optimale Laserleistung sicher und wählen Sie die PMT HV/Offset-Einstellungen, um die Fluoreszenz der Probe zu erfassen.
- Öffnen Sie die Symbolleiste "ND-Erfassung" unter "Erfassungssteuerung".
- Wählen Sie die Registerkarte "Einrichtung der Z-Serie" (stellen Sie sicher, dass alle anderen Registerkarten deaktiviert sind).
- Fokussieren Sie während des Live-Scans auf den oberen Rand der Probe und drücken Sie die Taste "Top".
- Fokussieren Sie auf den unteren Rand der Probe und drücken Sie die Schaltfläche "Unten".
- Geben Sie die gewünschte Schrittgröße ein (oder drücken Sie die Taste für die optimierte Schrittgröße).
- Drücken Sie die Schaltfläche "Jetzt ausführen".
- Speichern Sie die resultierenden Z-Stapel als einzelne Tiff-Bildstapel (1 Fluorochrom pro Bild-Z-Stapel).
- Verwenden Sie Bild-Z-Stacks, um 3D-Volumenbereiche von Interesse mit 3D-Analysesoftware zu rekonstruieren (z. B. mit Imaris x64 7.2.3, wie unten beschrieben).
- Starten Sie die Analysesoftware.
- Wählen Sie die Schaltfläche "Surpass" in der Symbolleiste für die 3D-Volumengenerierung
.
- Öffnen Sie den Z-Stapel des ersten Farbbilds (z. B. DAPI).
- Verwenden Sie das Werkzeug "Kanal hinzufügen", um zusätzliche Farbkanäle hinzuzufügen, einen Kanal pro Fluorochrom. Daher benötigt eine Probe, die sowohl DAPI- als auch Alexa-Fluor-594-Fluorochrome enthält, zwei Kanäle.
- Verwenden Sie das Werkzeug "Bildeigenschaften", um die korrekten Pixelabmessungen (XYZ) einzustellen, wie in 3.7 oben festgelegt.
- Verwenden Sie das Werkzeug "Anzeigeanpassung", um die Kanalfarben nach Bedarf zu ändern (z. B. DAPI-Kanal auf blau, Alexa Fluor 594-Kanal auf rot).
- Um das 3D-Volumen im Bildfenster zu positionieren, klicken Sie mit der Computermaus auf das Volumen und ziehen Sie es nach Bedarf.
- Verwenden Sie das Werkzeug "Schnappschuss" in der Symbolleiste, um Screenshots des 3D-Bildes zu erstellen.
- Verwenden Sie das Werkzeug "Animation" in der Symbolleiste, um Filme mit 3D-Sample-Rotation zu erzeugen.
