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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Genetisch veränderte primäre menschliche Keratinozyten
HINWEIS: Verwenden Sie amphotrope Phönixzellen, die in vollständigen DMEM-Medien [DMEM + 10% fötales Rinderserum (FBS) + Stift/Streptokokken] gezüchtet wurden, um Viren zu produzieren, die primäre menschliche Keratinozyten infizieren. Virale Verpackungsgene, die für Proteine wie gag-pol und Hülle kodieren, werden stabil in das Genom der Phönixzelle integriert, was die Virusproduktion ermöglicht, wenn sie mit einem retroviralen Vektor transfiziert werden. Phoenix-Zellen können mit hoher Effizienz transfiziert werden, was eine hohe Virustiterproduktion ermöglicht. Viren, die in dieser Verpackungslinie hergestellt werden, können auch eine Vielzahl von Säugetierzellen, einschließlich des Menschen, infizieren.
- Tag 1: Am Tag vor der Transfektion werden Phönixzellen in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 800.000 Zellen pro Well in vollständigen DMEM-Medien ausgesät.
- Tag 2: Am Tag der Transfektion verwenden Sie 3 μg retrovirale Vektoren pro Vertiefung. Aliquotieren Sie 3 μg des retroviralen Vektors in ein 1,5-ml-Röhrchen. Verwenden Sie eine Mischung aus 100 μl DMEM plus 6 μl Transfektionsreagenz pro 3 μg Vektor. Mischen Sie 6 μl Transfektionsreagenz mit 100 μl DMEM in einem 1,5 ml-Röhrchen. (Die verwendeten retroviralen Vektoren sind in der Geräte-/Materialtabelle aufgeführt)
- 5 Minuten inkubieren und das 106-μl-Gemisch in das präaliquotierte Röhrchen geben, das 3 μg retroviralen Vektor enthält. Mischen und 30 min bei RT inkubieren. Gib diese gesamte Mischung tropfenweise in jede Vertiefung der Phönixzellen.
- Tag 3: Am Tag nach der Transfektion entfernen Sie das Medium aus den Phönixzellen und fügen Sie 2 ml frisches vollständiges DMEM-Medium hinzu. Am selben Tag seeden Sie primäre humane Keratinozyten in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 75.000 Zellen pro Well. Halten Sie die Keratinozyten in einem keratinozytenserumfreien Medium (KCSFM) mit Antibiotika (Pen/Streptokokken).
Anmerkung: Es wurden primäre humane Keratinozyten gekauft. Zellen können von einer Vielzahl von Anbietern erworben werden (aufgeführt in der Tabelle Materialien).
- Tag 4: Ernte das Medium aus den transfizierten Phönixzellen, die nun Viruspartikel enthalten. Führen Sie das Medium mit einer Spritze durch einen 0,45-μm-Filter (um kontaminierende Phönixzellen zu entfernen) und geben Sie 2 ml auf die Keratinozyten (am Vortag mit 75.000 Zellen/Vertiefung plattiert). Geben Sie Hexadimethrinbromid (5 μg/ml) in das Medium, um den Infektionsprozess zu unterstützen. Die viralen Titer betragen ~1 x 107 TU/ml.
- Die 6-Well-Platten in einer Zentrifuge bei 200 x g für 1 Stunde bei RT drehen. Entfernen Sie nach dem Schleudern das virushaltige Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS, bevor Sie KCSFM hinzufügen.
- Tag 5: Infizieren Sie die gleiche Charge von Keratinozyten erneut wie in 1.4 mit 2 ml gefilterten Medien, die Hexadimethrinbromid (5 μg/ml) enthalten. Schleudern Sie es bei 200 x g für 1 Stunde bei RT, um virenhaltige Medien zu entfernen, und waschen Sie es mit 1x PBS, dann fügen Sie KCSFM.
hinzu
Anmerkung: Selektieren Sie die Keratinozyten mit einem Medikament, wenn sich ein selektierbarer Marker auf dem retroviralen Vektor befindet, und erweitern Sie sie für die Verwendung in nachgelagerten Analysen oder Anwendungen wie organotypischen Kulturen.