Keratinozyten-Koloniebildungs-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Fähigkeit von Keratinozyten, zu Kolonien zu wachsen

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Gewinnung und Aussaat von primären Keratinozyten

1. Einschläferung von vier bis fünf erwachsenen weiblichen Mäusen durch CO₂ -Inhalation gemäß den Standards der zugelassenen Tiereinrichtung/IACUC. Dieses Protokoll kann jedoch auch für einzelne weibliche/männliche Mäuse verwendet werden.
   1. Schneiden Sie ca. 9 cm² des Rückenfells mit einer elektrischen Tierschermaschine ab und legen Sie alle geschorenen Mäuse in ein 500-ml-Glas mit ausreichend Povidon-Jod-Antiseptikum (kein Peeling), um sie 1-2 Minuten lang zu bedecken. Schütteln Sie das Glas gut, um die antiseptische Lösung gleichmäßig über die Mäuse zu beschichten.
   2. Gießen Sie die Lösung ab und spülen Sie sie mit klarem Wasser ab, bis die Flüssigkeit klar ist. Wiederholen Sie die gleiche antiseptische Wäsche, gefolgt von einer Wasserspülung. Nach der antiseptischen Wäsche mit Jodlösung alle Mäuse 5-10 Min. in 70%igem Ethanol einweichen
      HINWEIS: Mäuse mit hellem Fell (z. B. BALB/c) behalten eine leicht gelbliche Farbe durch die antiseptischen Jodwaschungen, während dunklere Mäuse (z. B. C57BL/6) dies nicht tun. Insbesondere die Lebensfähigkeit der Zellen oder das Kulturwachstum werden durch die gelbe Farbe nicht beeinträchtigt.
2. Entfernen Sie die abgeschnittene Rückenhaut vorsichtig mit einer Daumenzange und einer Schere in einer Laminar-Flow-Haube. Legen Sie die herausgeschnittene Rückenhaut in ein konisches Röhrchen, das mit PBS/2x Gentamycin gefüllt ist. Vermeiden Sie die Verwendung von ventraler Seitenhaut, um eine Kontamination der Brustzellen in Kultur zu verhindern.
3. Legen Sie mit einer autoklavierten Pinzette und einem Skalpell eine dorsale Haut nach der anderen mit der behaarten Seite nach unten auf eine dünne Petrischale. Beginnen Sie mit dem Abkratzen des gesamten Unterhautgewebes, einschließlich des Fettes von der ventralen Seite des Hautgewebes, bis es halbdurchsichtig ist. Versuchen Sie, möglichst viele Spuren von Unterhautgewebe zu entfernen, ohne die Haut (Haarfollikelteil) zu zerreißen. Kratzen Sie auch nicht lange und vermeiden Sie ein Austrocknen der Haut.
   1. Bewahren Sie die abgeschabte Haut in PBS-Lösung auf, bis alle anderen verbleibenden Häute verarbeitet sind. Schneiden Sie dann mit einem Skalpell die Häute in 0,5 cm x 1-1,5 cm große Streifen und legen Sie die behaarte Seite nach oben auf eine sterile Petrischale.
4. 20 ml PBS/2x Gentamicin-Lösung, gemischt mit Trypsin (0,25 %), vorsichtig in eine 100 mm x 20 mm große Petrischale aus Kunststoff pipettieren. Übertragen Sie die Häute mit einer sterilen Pinzette und schweben Sie mit der haarigen Seite nach oben auf der Oberfläche der Trypsinlösung für 2 h in einem 32 °C heißen Inkubator.
   HINWEIS: Die Trypsinisierungszeit und -temperatur sind entscheidend für eine gute Ausbeute an hochkultivierbaren primären Keratinozyten. Obwohl andere Methoden gute Ausbeuten an lebensfähigen Zellen liefern können, war die Kultivierbarkeit der Keratinozyten weniger zufriedenstellend.
   1. Während dieser 2-stündigen Inkubationszeit werden die Schalen mit einer Kollagenbeschichtung bestreicht und 1 Stunde lang bei 37 °C aufgestellt (siehe Schritt 1.1.2). Für klonogene Assays werden die 60-mm-Petrischalen 24 Stunden vor der Keratinozytenentnahme beschichtet, damit sich die bestrahlte 3T3-Feederschicht am Boden anheften und gleichmäßig verteilen kann.
      Anmerkung: Die Beschichtung von Kulturschalen für klonogene Kulturen ist sehr wichtig für die korrekte Bindung, die Koloniebildung und das endgültige Wachstum/die Proliferation der epidermalen Keratinozyten von Mäusen.
5. Schritt des epidermalen Schabens: Ordnen Sie eine sterile quadratische Petrischale aus Kunststoff an und schaffen Sie eine Oberfläche in einem Winkel von 30° für ein ordnungsgemäßes Abkratzen der Epidermis mit 15 ml Entnahmemedium (siehe Tabelle 1). Entfernen Sie vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette einen schwimmenden Hautstreifen aus der Trypsinlösung. Kratzen Sie dann mit einer neuen Skalpellklinge die Epidermis und die Haare in das Medium ab.
   1. Wenden Sie keine übermäßige Kraft an, sondern wenden Sie genügend Kraft an, um die Epidermis abzukratzen oder die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen.
   2. Halten Sie die Klinge während des Schabens der Epidermis senkrecht zum Hautstück. Wenn die Klinge zur Bewegung der Klinge abgewinkelt ist, besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass die Haut reißt. Wenn die Klinge von der Klingenbewegung weg abgewinkelt ist, besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass die Epidermis unvollständig entfernt wird.
6. Gießen Sie das Erntemedium mit den geschabten Epidermiszellen vorsichtig in ein steriles 60-ml-Glas (autoklavierbar und wiederverwendbar) mit einem 1,5-Zoll-Magnetrührstab. Spülen Sie die Petrischale mit einem zusätzlichen Erntemedium aus, um die verbleibenden Epidermiszellen zu sammeln und das endgültige Volumen auf 30 ml zu bringen. Verwenden Sie einen Magnetrührer und rühren Sie 20 Minuten lang bei 100 U/min bei Raumtemperatur. Durch diesen Vorgang werden die eingeschlossenen Epidermiszellen aus den Haaren entfernt.
7. Legen Sie ein steriles 70-μm-Zellsieb auf ein konisches 50-ml-Röhrchen. Das Zellsieb passt auf ein konisches 50-ml-Röhrchen.
   1. Nehmen Sie das Glas in eine Biosicherheitshaube. Entfernen Sie den Rührstab und gießen Sie den Inhalt in den Siebfilter, der an einem konischen 50-ml-Röhrchen befestigt ist. Unerwünschte Haare und Schichten des Stratum corneum abseihen.
   2. Drücken Sie die Haare zusammen mit den Stratum corneum-Materialien in das Sieb und manipulieren Sie sie, um die eingeschlossenen Haarzellen freizusetzen. Verwenden Sie 5 ml Erntemedium, damit sich die verbleibenden gefangenen Zellen lösen und in das Röhrchen fließen können. Bringen Sie das Gesamtvolumen in einem konischen Röhrchen auf bis zu 50 mL.
8. Das konische 50-ml-Röhrchen mit Zellfiltrat verschließen und bei 160 x g für 7 min bei 4 °C zentrifugieren. Als nächstes aspirieren Sie den Überstand und fügen 5 mL Erntemedium hinzu. Zum Schluss resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie es ~20x vorsichtig mit einer 5-ml-Pipette verreiben.
   1. Bewahren Sie die Zellen in diesem Schritt in einer Eisbox auf, um eine Aggregation zu vermeiden. Als nächstes fügst Du 25 mL Erntemedium hinzu und zerkleinerst erneut (20-25x).
   2. Um eine genaue Keratinozytenzahl in diesem Schritt zu gewährleisten, nehmen Sie 1 ml Zellsuspension und fügen Sie 19 ml Entnahmemedium hinzu. Nun beträgt die Zellverdünnung 1:20 in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Wenn Keratinozyten von einer einzigen Maus entnommen werden, passen Sie das Volumen der Zellsuspension an. Verwenden Sie beispielsweise anstelle von 30 ml 15 ml und führen Sie eine Verdünnung von 1:10 für die Zählung der Zellen durch.
9. Pipettieren Sie 0,5 ml verdünnte Zellen aus dem konischen 50-ml-Röhrchen (1:20-Verdünnung) und geben Sie es in ein autoklaviertes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Nehmen Sie 0,2 ml (200 μl) Zellmischung in ein weiteres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen (200 μl) 0,4%iger Trypanblau-Lösung hinzu. Mischen Sie diese Lösung vorsichtig 3x und übertragen Sie die Zellen auf ein Hämozytometer, um kernhaltige Keratinozyten zu zählen.
   1. Bewerten Sie alle dunkelblauen Zellen positiv für Trypanblau als nicht lebensfähige tote Zellen und bewerten Sie kleine goldene und rosafarbene Zellen als lebensfähige Zellen. Die endgültige Keratinozytenausbeute pro Maus sollte also bei etwa 30 Millionen lebensfähigen Zellen liegen.
10. Das ursprüngliche konische 50-ml-Röhrchen (aus Schritt 1.8) wird 7 min lang bei 160 x g bei 4 °C zentrifugiert. In diesem Schritt resuspendieren Sie die Zellen in dem gewünschten Medium und nehmen Sie die erforderliche Verdünnung für die Aussaat der Zellen vor.
    1. Für die Massenkultur werden 2 bis 4 Millionen lebensfähige Goldzellen in jeder 35-mm-Petrischale in Zellkulturmedium (KGM-Medium + Ergänzungen für Monolayer-Kulturen) ausgesät (siehe Tabelle 1). Für einen klonogenen (Koloniebildung) Assay säen Sie 1.000 Zellen pro 60 mm Petrischale auf röntgenbestrahlten Schweizer Maus 3T3 Feeder-Schichten mit Kollagen-Beschichtung und modifiziertem Willia's E-Medium mit Zusätzen und Serum.
    2. Verwenden Sie insgesamt 2 bis 4 mL Medium für 35 mm bzw. 60 mm Petrischale. Formulieren Sie außerdem DMEM und Williams E-Medium, das von ATCC bezogen wurde, mit reduzierten Gehalten an Natriumbicarbonat für die Verwendung bei 5 % CO₂.
11. Züchten Sie die Kulturzellen (Masse oder klonogen) bei 32 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO₂. Wechseln Sie das Medium einen Tag nach der ersten Aussaat für die Massenkultur und danach 3x wöchentlich. Bei klonalen Assays erfolgt der erste Mediumwechsel jedoch 2 Tage nach der Zellaussaat und danach 3x wöchentlich
.
12. Für die klonale Kultur kultivieren Sie die Zellen in Abständen von zwei und vier Wochen. Nach Abschluss der klonalen Kulturen (2 oder 4 Wochen) aspirieren Sie das Medium. Fixieren Sie die Kolonien in 10% gepuffertem Formalin über Nacht bei Raumtemperatur und färben Sie sie 1 h lang mit 0,5% Rhodamin B in Autoklavenwasser. Entfernen Sie dann den Rhodamin-B-Fleck mit einer Pipette vom Rand des Geschirrs.
    1. Spülen Sie das Geschirr mit kaltem autoklaviertem Wasser aus, bis das Geschirr klar ist. Stellen Sie die Schalen schräg auf den Deckel der Schalen und lassen Sie sie trocknen, um die Kolonie abschließend zu zählen. Insbesondere bei der Durchführung eines klonogenen Kulturassays sollten Sie niemals <1 ml Zellen pipettieren. Wenn Zellen konzentriert sind, verdünnen Sie die Zellkonzentration seriell.

Tabelle 1: Lösungs- und Medienrezepturen.