Methodenartikel

miniCoopR-Vektor-basierte Transgenese: Eine Technik zum Screening von Melanom-induzierenden Genen im Zebrafisch-Tumormodell

30. April 2023

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Iyengar, S. et al. Screening auf Melanommodifikatoren unter Verwendung eines autochthonen Tumormodells des Zebrafisches. J. Vis. Exp. (2012)

Dieses Video beschreibt eine Methode zum Screening nach Melanom-modifizierenden Genen unter Verwendung eines transgenen Zebrafisch-Tumormodells. Wenn der Zebrafisch mit einem Melanom-induzierenden miniCoopR-Vektor injiziert wird, entwickelt er Melanome und kann daher zur Untersuchung der genetischen Faktoren verwendet werden, die die Tumorentwicklung beim Zebrafisch beeinflussen.

Protokoll

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Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Screening auf Melanom-Inset-Modifikatoren

  1. Herstellung von Gateway-Klonen mit mittlerem Eintritt durch PCR, Amplifikation des offenen Leserahmens von Genen von Interesse (GOI) in voller Länge und Rekombination zu pDONR 221 unter Verwendung von BP-Klonase II (Invitrogen). Verwenden Sie die Multisite-Gateway-Technologie (Invitrogen), um p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA und miniCoopR zu rekombinieren, um interessante Gene unter dem mitfa-Promotor....

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Ergebnisse

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Abbildung 1. Screening auf Melanom-Onset-Modifikatoren mit dem miniCoopR-Assay. A) Schematische Darstellung des miniCoopR-Assays. Embryo mit geretteten Melanozyten (Pfeilspitze), die den miniCoopR-Vektor und das interessierende Gen enthalten. Maßstabsbalken = 250 μM. Erwachsener mit mehr als 4 mm2 Melanozyten-Rettung (Pfeilspitze). Maßstabsbalken = 500 μM B)

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gateway-Rekombinations-ReagenzienInvitrogen
miniCoopR
Mitfa Antikörper
FITC Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-AntikörperInvitrogen
VectashieldVektor-LaboreH-1000
Casper Zebrafisch
701N 10 μl SpritzeHamilton/FischerTel.: 14-824
40 μM FilterBD Falke/FischerArtikel-Nr.: 352340
FBSInvitrogen26140079

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Schlagwörter

Transposon basierte TransgeneseMitfa PromotorScreening von KandidatengenenMelanozyten RescueAnalyse der TumorentwicklungMelanom freies berlebenLog Rank Test

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