miniCoopR-Vektor-basierte Transgenese: Eine Technik zum Screening von Melanom-induzierenden Genen im Zebrafisch-Tumormodell

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Screening auf Melanom-Inset-Modifikatoren

1. Herstellung von Gateway-Klonen mit mittlerem Eintritt durch PCR, Amplifikation des offenen Leserahmens von Genen von Interesse (GOI) in voller Länge und Rekombination zu pDONR 221 unter Verwendung von BP-Klonase II (Invitrogen). Verwenden Sie die Multisite-Gateway-Technologie (Invitrogen), um p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA und miniCoopR zu rekombinieren, um interessante Gene unter dem mitfa-Promotor im miniCoopR-Vektor zu platzieren (Abbildung 1A).
2. Injizieren Sie 25 Pikogramm von jedem Klon zusammen mit 25 Pikogramm Tol2-Transposase-mRNA in eine Zell-Tg(mitfa:BRAFV600E); S. 53 (LF); mitfa(lf)dreifach homozygote Zebrafischembryonen wie zuvor beschrieben. Die injizierten Embryonen werden bei 28,5 °C inkubiert. Alle toten Embryonen werden bei 24 hpf entfernt.
3. Wählen Sie transgene Tiere mit geretteten Melanozyten bei 72 hpf aus, indem Sie die Petrischale mit den injizierten Embryonen unter Auflicht vor weißem Hintergrund auf ein Präpariermikroskop legen (Abbildung 1A).
4. Setzen Sie die Tiere in 3-Liter-Becken in der Aufzuchtstation der Zebrafischanlage bei 4 dpf um.
5. Nach 2 Monaten sind die Tiere auszuwählen, bei denen mindestens ein Melanozyten-Rettungsbereich größer als 4 mm^{ist 2} (Abbildung 1A). Es besteht eine starke Korrelation zwischen dem Grad der Melanozyten-Rettung bei 72 hpf und dem Grad der Melanozyten-Rettung nach 2 Monaten. Wenn Embryonen mit Melanozytenrettung bei 72 hpf entnommen werden, hat die Mehrheit von ihnen (~80%) nach 2 Monaten mindestens einen Bereich mit Melanozytenrettung von mehr als 4 mm².
6. Untersuchen Sie die ausgewählten Tiere wöchentlich auf das Vorhandensein von Tumoren (Abbildung 1B). Es besteht eine starke Korrelation zwischen histopathologischen und morphologischen Veränderungen. Der Übergang von gutartig zu bösartig wird als morphologische Veränderung erkannt, wenn sich Läsionen von der Oberfläche des Tieres abheben. Isolierung tumortragender Tiere für Studienzwecke.
7. Zeichnen Sie melanomfreie Überlebenskurven mit dem Alter in Wochen auf der Abszisse und das prozentuale melanomfreie Überleben auf der Ordinate. Tiere mit Melanozyten, die ein interessierendes Gen exprimieren, werden mit Kontrolltieren verglichen, die EGFP (enhanced green fluoresscent protein) in Melanozyten exprimieren (Abbildung 1C). Der mediane Tumorbeginn bei Tieren, denen miniCoopR-EGFP injiziert wird, beträgt etwa 18 Wochen. Ermitteln Sie, ob sich die beiden Kurven statistisch unterscheiden, indem Sie einen logarithmischen Rangtest durchführen.

Abbildung 1. Screening auf Melanom-Onset-Modifikatoren mit dem miniCoopR-Assay. A) Schematische Darstellung des miniCoopR-Assays. Embryo mit geretteten Melanozyten (Pfeilspitze), die den miniCoopR-Vektor und das interessierende Gen enthalten. Maßstabsbalken = 250 μM. Erwachsener mit mehr als 4 mm2 Melanozyten-Rettung (Pfeilspitze). Maßstabsbalken = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP rettete einen Zebrafisch mit einem amelanotischen und einem pigmentierten Tumor (Pfeilspitzen). C) Repräsentative melanomfreie Überlebenskurve zum Vergleich von Tumoren, die das Onkogen SETDB1 exprimieren, und einem Kontroll-EGFP-Gen (p = 9,4×10-7, log-Rang χ2).