Antikörperfärbung von Schuppenmelanozyten: Eine Technik zum Nachweis von Transkriptionsfaktoren, die in dorsalen schuppenassoziierten Melanozyten von Zebrafischmodellen exprimiert werden

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Sharanya Iyengar et al. Screening auf Melanommodifikatoren unter Verwendung eines autochthonen Zebrafisch-Tumormodells. J. Vis. Exp. (2012)

Dieses Video beschreibt die Antikörper-Färbemethode zum Nachweis der Expression von Transkriptionsfaktoren in dorsalen schuppenassoziierten Melanozyten von Zebrafischmodellen. Diese Immunfärbetechnik hilft spezifisch bei der Identifizierung des Melanozyten-induzierenden Transfektionsfaktors-A im transgenen Zebrafisch.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Antikörperfärbung von Schuppenmelanozyten

PO₄ Puffer mit 80 mL 0,1M Na₂HPO₄ und 20 mL 0,1M NaH₂PO₄ auffüllen. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert 7,3 beträgt. Stellen Sie 2x Fix-Puffer her, der 8,0 g Saccharose, 0,15 mL 0,2 M CaCl₂ und 90 mL 0,2 M PO₄ Puffer enthält, pH 7,3. Falls erforderlich, den pH-Wert mit NaOH oder HCl auf 7,3 einstellen, dann mit PO₄ Puffer auf 100 ml auffüllen.
Wiegen Sie bis zu 300 mg festes PFA und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 5 mM NaOH werden zu einem Volumen hinzugefügt, das 4,5 x Masse in mg PFA entspricht (z. B. 450 ul 5 mM NaOH zu 100 mg PFA). Bei 60-70 °C unter gelegentlichem Schütteln erhitzen, bis sich das PFA aufgelöst hat. Verbleibende Partikel werden abgebaut und 20 % PFA-Überstand zurückgewonnen. Machen Sie es jedes Mal frisch.
Fixierlösung mit 1x Fixpuffer und 4 % PFA herstellen.
Betäuben Sie den Fisch in 0,17 mg/ml Tricain.
mit einfallendem Licht unter einem Präpariermikroskop die Rückenschuppen mit einer scharfen Pinzette mit feiner Spitze und achten Sie darauf, die melanozytenhaltige Hälfte der Schuppe nicht zu beschädigen (Abbildung 1A). Legen Sie die Waage direkt von der Pinzette in eine 1 ml-Fixierlösung und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur unter Wenden für ≥ 2 Stunden. Setzen Sie den Fisch in Fischwasser um und überwachen Sie den Fisch, um die erfolgreiche Genesung zu bestätigen.
Um pigmentierte Melanozyten zu bleichen, waschen Sie feste Schuppen in PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 Mal für 5 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie 1 ml frisch hergestellte Bleichlösung mit 0,4 mL 10 % KOH und 0,15 mL 30 % H₂O₂ in 5 mL mit dH₂O hinzu. Setzen Sie Parafilm oder Kappenverschlüsse auf, um zu verhindern, dass Gas die Röhrchen aufplatzt. Bleichen Sie weiter, bis das Pigment verschwunden ist (10 Minuten sind typisch) (Abbildung 1B, C). In PBST viermal für 5 min bei Raumtemperatur waschen.
Mindestens 30 min in Blocklösung bestehend aus 1x PBS pH 7,4, 0,2 % Triton X-100, 2 mg/ml BSA, 1 % DMSO, 0,02 % NaN₃ und 2 % Lammserum blockieren. Lassen Sie NaN₃ weg, wenn es sich mit HRP-Reaktion entwickelt.
Mit dem Primärantikörper in Blocklösung über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Sie müssen mindestens 400 μl Lösung über die Proben haben, um sie unter Wasser zu halten.
Waschen Sie die Waage 3 Mal für 30 min in PBST bei Raumtemperatur.
Inkubieren Sie mit einem Sekundärantikörper von 2 Stunden bis über Nacht in Blocklösung bei Raumtemperatur.
10 min mit PBST + 0,1 μM DAPI färben.
3 Mal für 5 min mit PBST waschen.
Montieren Sie die Waage auf einem Objektträger in einem Tropfen vectashield, so dass die konkave Seite der Waage nach unten zum Objektträger zeigt, und legen Sie einen Glasdeckel darüber. Versiegeln Sie die Ränder des Objektträgers mit klarem Nagellack und betrachten Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 1D, E, F, G).

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Ergebnisse

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Abbildung 1. Antikörperfärbung von Schuppenmelanozyten. A) Schuppen, die von einem anästhesierten miniCoopR-EGFP-Zebrafisch gepflückt werden. B) Ungebleichte Schuppen mit pigmentierten Melanozyten und C) gebleichte Schuppen von miniCoopR-EGFP Zebrafischen. Maßstabsbalken = 100 μM. Ungebleichter Zunder, gefärbt mit einem ...