Subkutaner Transplantationsassay: Eine Methode zur Transplantation von Melanomzellen von einem Spender in ein Empfänger-Zebrafischmodell

Zusammenfassung

Quelle: Iyengar, S. et al. Screening auf Melanommodifikatoren unter Verwendung eines autochthonen Tumormodells des Zebrafisches. J. Vis. Exp.(2012)

Dieses Video beschreibt die Methode zur Transplantation von Tumorzellen aus dem Melanom-tragenden Spender-Zebrafischmodell zu einem immungeschwächten Empfänger-Casper-Zebrafisch. Es hilft, die Tumortransplantation und -proliferation im Empfängerfisch sichtbar zu machen.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Transplantations-Assay

1. Bereiten Sie den 2-3 Monate alten Casper-Fisch des Empfängers vor, indem Sie ihn einen Tag vor der Transplantation mit 25 Gy Gammabestrahlung bestrahlen. Lassen Sie den Fisch sich im Fischwasser erholen.
2. Euthanasieren Sie einen tumortragenden Fisch gemäß den institutionellen Richtlinien. Konkret wird ein Fisch in eine Schale mit 0,6 mg/ml Tricain gelegt, bis die Kiemenbewegung stoppt.
3. Schneiden Sie den Tumor ab und geben Sie ihn in eine Petrischale mit ca. 5 mL Filter, sterilisiert 0,9x PBS mit 5% FBS. Würfeln Sie den Tumor mit einem Rasierer, während er sich in Lösung befindet.
4. Bei Raumtemperatur mit einer P1000-Pipette zerreiben, um einzelne Zellen zu erhalten. Füllen Sie das Volumen auf 25 mL mit einem Filter auf, der 0,9x PBS mit 5% FBS sterilisiert ist.
5. Filtern Sie durch einen 40 μM Maschenfilter.
In
6. einer Eppendorf 5810R Tischzentrifuge bei 1.500 U/min (453 rcf) für 10 min drehen.
7. Entfernen Sie den Überstand und stellen Sie die Zellsuspension auf die ungefähr gewünschte Konzentration her (gehen Sie von 10⁷ Zellen für einen 100 mm³ Tumor aus).
8. Berechnen Sie die genaue Zellzahl mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Zellsuspension so, dass das endgültige Injektionsvolumen etwa 5 μl beträgt. Wenn beispielsweise 50.000 Zellen injiziert werden sollen, sollte die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10.000 Zellen/μl verdünnt werden. Drehen Sie alle paar Minuten mit dem Röhrchen mit der Zellsuspension, um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern.
9. Waschen Sie eine 26s Gauge (abgeschrägte Spitze) 701 N 10 μl Hamilton-Spritze 2-3 Mal mit 100 % Ethanol und 0,9x PBS. Laden Sie die Spritze mit 5 μl der Zellsuspension.
10. Betäuben Sie den bestrahlten Empfängerfisch in 0,17 mg/ml Tricain. Legen Sie den Fisch auf die Seite auf ein feuchtes Kimwipe (Abbildung 1A).
11. Stabilisieren Sie den Fisch mit einer Hand und führen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in einem 45°-Winkel in die Flanke des Fisches oberhalb der Bauchhöhle ein, etwa auf halber Höhe zwischen der hinteren Begrenzung des Hinterhirns und dem vorderen Rand der Rückenflosse. Drücken Sie den Kolben vorsichtig nieder (Abbildung 1B).
12. Lassen Sie den Fisch sich in frischem Fischwasser erholen und beobachten Sie den Fisch täglich auf Tumortransplantation (Abbildung 1C). Ist eine Transplantation erfolgt, kann auch ein kontinuierliches Wachstum und eine Krankheitsentwicklung beobachtet werden.

Ergebnisse

Abbildung 1. Transplantation von Melanomzellen. A) Nicht injizierter Casper-Zebrafisch. Maßstabsbalken = 500 μM. B) Subkutane Transplantationsstelle (Pfeilspitze) auf einem bestrahlten Casper-Empfänger unmittelbar nach der Injektion mit 50.000 Melanomzellen. Maßstabsbalken = 200 μM. C) Bestrahlter Casper-Empf...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gateway-Rekombinations-Reagenzien	Invitrogen
miniCoopR
Casper Zebrafisch
701N 10 μl Spritze	Hamilton/Fischer	Tel.: 14-824
40 μM Filter	BD Falke/Fischer	Artikel-Nr.: 352340
FBS	Invitrogen	26140079