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>1. Vorbereitung von Medien und Reagenzien
- Aufbereitung von 200x L-Ascorbinsäure-2-phosphat-Stamm
- Lösen Sie 29 mg L-Ascorbinsäure-2-phosphat pro 5 mL Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Lösung und filtrieren Sie durch einen 0,22 μm Membranfilter. Als sterile 0,25-ml-Aliquote bei -20 °C lagern.
- Geben Sie am erforderlichen Tag 0,25 ml aliquotes 200x L-Ascorbinsäure-2-Phosphat-Stamm zu jeweils 50 ml Fibroblastenmedium (DMEM mit 1 % L-Glutamin und 10 % fötalem Rinderserum) für eine Endkonzentration von 0,1 mM L-Ascorbinsäure-2-phosphat.
- Aufbereitung von Keratinozyten-Wachstumsmedien
- Die Isolierung und Kultivierung von Keratinozyten des primären Plattenepithelkarzinoms (SCC) wurde bereits beschrieben. Auch die Herstellung von Keratinozyten-Wachstumsmedien wird darin beschrieben.
- Bereiten Sie die Medien kurz wie folgt vor:
300 mL DMEM und 100 mL F-12 von Ham, ergänzt mit 10 % FBS
0,4 mg/ml Hydrocortison
5 mg/ml Insulin
10 ng/ml EGF
5 mg/ml Transferrin
8,4 ng/ml Choleratoxin
13 ng/ml Liothyronin
1x Penicillin-Streptomycin-Lösung
>2. In-vitro-Konstruktion einer von Fibroblasten abgeleiteten nativen Matrix in L-Ascorbinsäure-2-Phosphat-supplementierten Medien
- 200.000 Fibroblasten pro Well in 6-Well-Platten (20.000 Zellen/cm2) in Fibroblastenmedien säen, die mit L-Ascorbinsäure-2-phosphat ergänzt sind. Füttern Sie alle 2-3 Tage mit 2-5 ml Medium. (Hinweis: Die Häufigkeit und das Volumen der Wiederfütterung können an die individuellen Bedürfnisse der verschiedenen Zellen angepasst werden.)
Am - Ende von 6 Wochen bildet sich eine dicke Zellschicht, die in die extrazelluläre Matrix eingebettet ist und mit bloßem Auge sichtbar ist (Abbildung 1). Um diese Schicht von der Gewebekulturplatte zu lösen, kratzen Sie vorsichtig mit einer 1 mL Mikropipettenspitze den Umfang der Matrix ab und schieben Sie dann die Ränder der Matrix in Richtung Mitte der Vertiefung. Diese Schicht aus Zellen und Matrix (native Matrix) sollte sich leicht von der Plattenoberfläche lösen lassen und nun im Medium schweben. Verteilen Sie die native Matrix in den Medien, um zu vermeiden, dass sie sich in sich selbst zusammenfaltet.
- Lassen Sie die native Matrix 5 Tage lang schweben und umgestalten, wobei das Medium alle 2-3 Tage gewechselt wird. Aufgrund der Zugfestigkeit und des intrinsischen Umbaus innerhalb der Matrix zieht sich die Matrix drastisch zusammen und wird auf eine kleinere, aber dickere native Matrix reduziert, die für den Invasionsassay verwendet werden kann.
>3. Invasionsassay mit Tumor-SCC-Keratinozyten
- Nehmen Sie die native Matrize vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette auf und übertragen Sie sie in ein Nylonnetz. Sobald Sie sich auf dem Nylonnetz befinden, verteilen Sie die Matrize vorsichtig, um so flach wie möglich zu liegen, indem Sie eine 1-ml-Mikropipettenspitze und eine stumpfe Pinzette verwenden.
- Bereiten Sie die sterilen klonalen Zylinder vor, indem Sie an einem Ende eine kleine Menge sterile Vaseline beschmieren.
- Platzieren Sie die klonalen Zylinder mit der Vaseline-Seite nach unten auf der nativen Matrix. Dies soll eine dichte Abdichtung zwischen der nativen Matrix und den klonalen Ringen gewährleisten.
- Geben Sie cSCC-Zellen in die klonalen Zylinder (250.000 Zellen in 100 μl Keratinozyten-Wachstumsmedium).
- Entfernen Sie die klonalen Zylinder nach 6 Stunden, wenn sich die cSCC-Zellen auf der nativen Matrix abgesetzt haben.
- Heben Sie das Nylonnetz mit der nativen Matrix und den cSCC-Zellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche auf eine gebogene Edelstahl-Drahtgeflechthalterung.
- Mit Ascorbinsäure ergänzte Keratinozyten-Wachstumsmedien hinzufügen, bis das Medium den Boden der nativen Matrix berührt.
- Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage und ernten Sie nach 7 und 14 Tagen, nach der Aussaat der cSCC-Zellen.
