Dieses Protokoll beschreibt, wie Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) verwendet wird, um den dynamischen Veränderungen der Chromatin-Vorlage, die Transkription von einem Signaltransduktionsweg induziert regulieren zu studieren.
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Methodenartikel
Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In Reaktion auf eine Vielzahl von extrazellulären Liganden, die STAT (Signal Transducer und Aktivator der Transkription) Transkriptionsfaktoren werden schnell von ihren latenten Zustand im Zytoplasma an Zelloberflächenrezeptoren, wo sie durch Phosphorylierung an einem Tyrosin-Rest 1 aktiviert werden rekrutiert. Dann dimerisieren und in den Zellkern transloziert, um die Transkription von Zielgenen fahren, die sich auf Wachstum, Differenzierung, Homöostase und der Immunantwort. Es überrascht nicht, angesichts ihrer weit verbreiteten Einbindung in normale Zelle Prozesse trägt Dysregulation der STAT-Funktion, um menschliche Krankheiten, insbesondere Krebs 2 und autoimmune Krankheiten 3.
Es ist bekannt, dass die Transkription von Änderungen ist es, die Chromatin-Template 4,5 geregelt. Diese Veränderungen umfassen die Aktivitäten von ATP-abhängigen Komplexen, sowie kovalenten Histon-Modifikationen und DNA-Methylierung 6. Da STAT Aktivierung der Genexpression ist schnell und transient, bedarf es spezifische Mechanismen für die Modulation der Chromatin-Template an STAT-abhängigen Gen-Loci. So definieren Sie diese Mechanismen charakterisieren wir die Histon-Modifikationen und die enzymatischen Aktivitäten, die sie an Genorte, die STAT-Signalisierung reagieren zu generieren. Dieses Protokoll beschreibt Chromatinimmunpräzipitation, eine Methode, die wertvoll für das Studium der STAT-Signalisierung an Chromatin in aktiviert die Genexpression.
Protokoll
PLANUNG
Der Tag vor einem ChIP Experiment geplant ist, sollten die Zellen kultiviert, so dass eine ausreichende Anzahl zur Verfügung steht. Angenommen, dass jeder ChIP-Assay wird ~ 1-1,5 x 10 7 Zellen benötigen. Immer Plan, sowohl die negative (IgG) und positive (Pan-Histon-Antikörper) Kontrollen und doppelte Experimente zu tun.
Tipp - 2FTGH Zellen benötigt jeder ChIP Assay etwa ein 15 cm Gewebe Kulturschale bei 80% Konfluenz.
TEIL 1: PREPARE Chromatin und PERFORM ChIP
- Entfernen Kulturmedien und induzieren Zellen für die Zeiten mit 20 ml 10% kosmischen Kälberserum (CCS....
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Diskussion
Die ChIP-Protokoll beschrieben wurde erfolgreich im Labor zum Testen mehr als zwanzig verschiedenen Histon-Modifikationen eingesetzt. Darüber hinaus haben wir Änderungen in der Belegung von Transkriptionsfaktoren charakterisiert, Histon-modifizierende Enzyme, Proteine, die Histon-Modifikationen und der RNA Polymerase II Transkription Maschinen zu erkennen, an mehreren IFN-γ induzierten Genen. Wir haben auch das Verfahren verwendet werden, um Veränderungen in Histon-Modifikationen während der Differenzierung von Krebssta.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von der University of Virginia, der University of Virginia Cancer Center und The Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust unterstützt. Wir danken den James E. Darnell Lab (Rockefeller University) der Robert Ross Lab (Fordham University) für die Zell-Linien.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyd | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamylalkohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease-Inhibitoren | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Äthanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycin | Roche Group | 100149 | |
| Glykogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Natriumacetat | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Natriumsalz der Desoxycholsäure | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histon H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA-Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
Referenzen
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
