Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Protocol

Reverse-Transkriptase-Reaktion

Schalten Heizblock auf 70-80 ° C und 42 ° C. Wasserbäder können auch in diesem Schritt verwendet werden. Wenn Sie Heizblöcke, setzte Wasser, so dass die Wärme gleichmäßig ist.

1. Primingreaktion
   1. Take 3 pg RNA
   2. Stellen Sie die Lautstärke auf 13 ul mit RNase freiem Wasser
   3. Add 2,5 ul random Hexamer Primer (2mg/mL)
2. Gut mischen und inkubieren bei 70-80 ° C für 8 Minuten. Dann, auf Eis für 5 min.
3. Bereiten RT-Cocktail (14,5 ul / rxn):
   
   

   Komponente

   Volumen

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-Aminoallyl)-2' Desoxyuridin-5'-triphosphat
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set
PCR-Qualität Random Hexamer Primer		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μ L
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR-Aufreinigungskit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Puffer			Zur Herstellung eines 1M Phosphatpuffers (KPO4, pH 8,5-8,7) kombinieren:9,5 mL 1M K2HPO4 und 0,5 ml 1M KH2PO4
Phosphat-Waschpuffer	Puffer			Für 100 mL Phosphat-Waschpuffer (5 mM KPO4, pH 8,0, 80 % EtOH) Mix: 0,5 ml 1 M KPO4 pH 8,5 + 15,25 mL MilliQ Wasser + 84,25 mL 95 % Ethanol. Der Waschpuffer wird leicht trüb sein.** WICHTIG: Der Phosphatwaschpuffer sollte täglich zubereitet werden.
Phosphatelutionspuffer	Puffer			Verdünnung 1 M KPO4, pH 8,5 bis 4 mM mit sterilem Wasser
Natriumcarbonatpuffer				(Na2CO3): 0,5 M, pH 9,0. 4,2 g NaHCO3 werden in 80 ml sterilem Wasser gelöst und der pH-Wert mit 10 N NaOH auf 9,0 eingestellt. Bringen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf bis zu 100 mL. Um eine 50 mM Lösung für die Farbstoffkupplungsreaktion herzustellen, 1:10 mit Wasser verdünnen. Hinweis: Die Zusammensetzung des Karbonatpuffers ändert sich im Laufe der Zeit; Machen Sie es alle paar Wochen bis zu einem Monat frisch.