Wirtszelle Faktoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Errichtung und Wartung von Kaposi-Sarkom (KS). Wir skizzieren Methoden zur Wirtszelle Faktoren in KSHV-infizierten DMVEC Zellen verändert zu identifizieren und in KS Tumorgewebe. Zellulären Genen durch Viren verändert wird als potenzielles Ziel (e) für neuartige Therapeutika dienen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Derzeit KS ist die vorherrschende HIV / AIDS-Malignome im südlichen Afrika und damit die Welt. 1,2 Es wird als angioproliferative Tumor des vaskulären endothelialen Zellen charakterisiert und produziert seltenen B-Zell-lymphoproliferativen Erkrankungen in Form von Pleuraerguss Lymphome (PEL) und einige Formen der multizentrischen Castleman-Krankheit. 3-5 Nur 1-5% der Zellen in KS-Läsionen aktiv unterstützen lytischen Replikation des Kaposi-Sarkoms-assoziierten Herpesvirus (KSHV), die als Erreger mit KS verbunden, und es ist klar, dass zelluläre Faktoren müssen Interaktion mit viralen Faktoren in den Prozess der Onkogenese und Tumorprogression. 6,7 Identifizierung neuartiger Host-Faktor Determinanten, die KS Pathologie beitragen wird für die Entwicklung prognostischer Marker für Tumorprogression und Metastasierung sowie bei der Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von KS wesentliche . 8 Das dazugehörige Video Details der Methoden, die wir verwenden, um Wirtszelle Genexpression Programme in dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (DMVEC) nach KSHV Infektion und in KS Tumorgewebe verändert zu identifizieren. 9 Sobald dysregulierten Gene durch Microarray-Analyse identifiziert werden, sind Veränderungen in der Proteinexpression bestätigt durch Immunoblot-und Dual gekennzeichnet Immunfluoreszenz. Änderungen in transkriptionelle Expression von dysregulierten Gene sind in vitro durch quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) bestätigt. Validierung von in vitro-Ergebnisse mit Hilfe von Archivierungs KS Tumorgewebe wird auch durch dual bezeichnet Immunchemie und Tissue Microarrays durchgeführt. 8,10 Unser Ansatz zur Identifizierung dysregulierten Gene in den KS Tumorgewebe Mikroumgebung ermöglichen die Entwicklung von in vitro und anschließend in vivo-Modell für Entdeckung und Bewertung potenzieller neuer therapeutischer für die Behandlung von KS.
Protokoll
1. KSVH Kultivierung und Infektion des DMVEC
- Die BCBL-1-Zelllinie, die ursprünglich aus einem menschlichen Körper Hohlraum Basis Lymphom isoliert, ist in komplettem RPMI 1640 Medium (Gibco, Grand Island, NY) kultiviert. BCBL-1-Zellen werden aus flüssigem Stickstoff entfernt, in Trockeneis transportiert und schnell für 1 Minute aufgetaut bei 37 ° C. Eine 50 ul-Aliquot der BCBL-1-Zellen bei einer Dichte 1x10 4 Zellen / ml auf 500 ml RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 1x Penicillin / Streptomycin ergänzt und verteilt in 175 cm-Kolben hinzugefügt, bei 50 ml / Flasche .
- Die Kolben des BCBL-1 Zellen werden dann bei 37 ° C in einer....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Methoden in diesem Bericht verwendet werden kann in einer Vielzahl von Labor-Einstellungen vorgenommen werden. Sie erfordern eine spezielle Ausrüstung oder den Zugang zu zentralen Einrichtungen. Die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wenn dabei Experimente mit infektiösen viralen Krankheitserreger wie KSHV, die den Einsatz einer mit Gentechnik-Stufe 3 (BSL-3) Einrichtungen erfordern kann. Tissue Akquisitionen müssen auch von den entsprechenden Institutional Review Boards (Ethikkommissionen) genehmigt werd.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken James EK Hildreth, Meharry Medical College, für seine Beratung und Überprüfung des Manuskripts. Wir danken auch Diana Marver für die Bearbeitung des Manuskripts. Zentrum für AIDS Gesundheit Disparitäten Forschung, NIH 5U54 RR019192-05;; die Meharry Zentrum für Klinische Forschung, NIH Grant P20RR011792; Diese Arbeit wurde von der Vanderbilt Meharry Center for AIDS Research (NIH P30 AI054999-05) unterstützt und von NIH gewähren P01 CA113239. DJA wurde teilweise durch Piloten Zuschüsse aus dem Vanderbilt-Meharry Center for AIDS Research (CFAR) und die Meharry Zentrum für Klinische Forschung (CRC) finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7,4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Natriumbutyrat | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2-Medien | Lonza Inc. | CC-3156 | + Ergänzung mit Bullet-Kits |
| DMVEC-Zellen (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Fetalkalbserum | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kammerobjektträger | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV-LANA-Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 Verdünnung/IFA |
| Galectin-3 Ziegen-pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| Esel-anti-Ziege FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Esel-anti-Ziege Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 Verdünnung/IFA |
| Einbettmedium | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield mit DAPI |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Esel-anti-Ziege-konjugiert | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western-Substrat | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotin-Kaninchen-anti-Ziege | Dako | 305-065-045 | |
| AP-Streptavidin-Konjugat | Dako | K 0492 (Kit) | |
| DNase-freies RNase-Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus Zentrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K Ultrazentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler Echtzeit-PCR-Detektionssystem | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S Fluoreszenzmikroskop | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT Zentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
Referenzen
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J.....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
