In situ-Protokoll für Butterfly Puppenstadium Flügel mit Ribosonden

Zusammenfassung

Um die Genexpression in den Puppenstadium Flügel Gewebe Bicyclus anynana untersuchen, stellen wir ein optimiertes Protokoll für in situ Hybridisierungen mit Ribosonden. Wir bieten auch Richtlinien für die weitere Optimierung des Protokolls für den Einsatz in Puppenstadium Flügel der andere Lepidopteren Arten.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen im Video-Format, ein Protokoll für in situ Hybridisierungen in Puppenstadium Flügel des Schmetterlings Bicyclus anynana mit Ribosonden. In situ Hybridisierungen, sind eine tragende Säule der Entwicklungsbiologie, nützlich, um die räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression in Geweben entwickeln auf der Ebene der Transkription zu studieren. Wenn Antikörper, die das Protein Produkte der Gen-Transkription Ziel noch nicht entwickelt worden, und / oder gibt es mehrere Genkopien eines bestimmten Proteins in das Genom, die nicht differenziert werden können mit den verfügbaren Antikörper ist, kann in situs verwendet werden. Während eine in-situ-Technik für die Larven Flügel-Discs verfügbar war, um den Schmetterling Gemeinde seit mehreren Jahren hat sich die aktuelle Protokoll für die größeren und fragile Puppenstadium Flügel optimiert.

Protokoll

TAG 1

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
   • 10x PBS
   • 1x PBS
   • 1x PBT
   • ddH ₂ O
     • Add DEPC für 0,1% Gesamtvolumen und schütteln kräftig Lösungen.
     • Autoclave.
   • 4% Paraformaldehyd Fix - mit PBS-DEPC
   • Proteinase K-Lösung - wenn Niederschlag vorhanden ist, Vortex kräftig, bevor Sie aliquoten
   • Verdauung Anschlagpuffer
   • Prähybridisierungspuffer
   • 50:50 PBT: Prähybridisierungspuffer
   • Hybridisierungspuffer
     • Lösungen sollten gehalten RNase-frei sein. Verwenden Sie entweder Glas-ware, die gebacken hat (4 Stunden bei 250 ° C) oder Einweg-K....

Diskussion

Optimierung bestehender Protokolle

In situ Hybridisierungen auf Larven Flügel Scheiben erfolgreich durchgeführt wurden mit Scheiben aus Precis coenia Schmetterlinge (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. Das derzeitige Protokoll hat sich von einer ausführlichen schriftlichen Protokoll auf Anfrage von der Carroll Lab für die Larven Flügel Färbungen angepasst. Die Veränderungen, die wir gemacht dienen, um Unterschiede zwischen Larven-und Puppenstadium Flügel Gewebe aufnehmen. Während Puppenstadium Hinterflüge.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fixierpuffer				4% Paraformaldehyd in PBS
PBT				0,1% Tween 20 in PBS
Proteinase-K-Lösung				2,5mg/ml Proteinase K in PBT
Puffer zur Beendigung der Verdauung				2 mg/ml Glycin in PBT
Vor-Hybridisierungspuffer				Für 50 ml PHB: 12 ml DEPC-behandeltes Wasser + 25 ml Formamid + 12,5 ml 20 x SSC + 50 µl Tween 20 + 500 µl 10 mg/ml Lachssperma (RNase-frei, vor Zugabe zur Lösung hitzedenaturiert).
Hybridisierungspuffer				1 mg/ml Glycogen zum Vor-Hybridisierungspuffer hinzufügen
Blockpuffer				50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA
Anti-DIG	Ab	Roche Group	11 093 274 910	Alkalische Phosphatase-konjugiert
DIG-Wasch- und Blockierpuffer-Set		Roche Group	11 585 762 001
Crystal Mount, wässriges Einbettmedium		Sigma-Aldrich	C0612	Einbettmedium