Um die Genexpression in den Puppenstadium Flügel Gewebe Bicyclus anynana untersuchen, stellen wir ein optimiertes Protokoll für in situ Hybridisierungen mit Ribosonden. Wir bieten auch Richtlinien für die weitere Optimierung des Protokolls für den Einsatz in Puppenstadium Flügel der andere Lepidopteren Arten.
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Methodenartikel
In situ-Protokoll für Butterfly Puppenstadium Flügel mit Ribosonden
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hier präsentieren wir Ihnen im Video-Format, ein Protokoll für in situ Hybridisierungen in Puppenstadium Flügel des Schmetterlings Bicyclus anynana mit Ribosonden. In situ Hybridisierungen, sind eine tragende Säule der Entwicklungsbiologie, nützlich, um die räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression in Geweben entwickeln auf der Ebene der Transkription zu studieren. Wenn Antikörper, die das Protein Produkte der Gen-Transkription Ziel noch nicht entwickelt worden, und / oder gibt es mehrere Genkopien eines bestimmten Proteins in das Genom, die nicht differenziert werden können mit den verfügbaren Antikörper ist, kann in situs verwendet werden. Während eine in-situ-Technik für die Larven Flügel-Discs verfügbar war, um den Schmetterling Gemeinde seit mehreren Jahren hat sich die aktuelle Protokoll für die größeren und fragile Puppenstadium Flügel optimiert.
Protokoll
TAG 1
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- ddH 2 O
- Add DEPC für 0,1% Gesamtvolumen und schütteln kräftig Lösungen.
- Autoclave.
- 4% Paraformaldehyd Fix - mit PBS-DEPC
- Proteinase K-Lösung - wenn Niederschlag vorhanden ist, Vortex kräftig, bevor Sie aliquoten
- Verdauung Anschlagpuffer
- Prähybridisierungspuffer
- 50:50 PBT: Prähybridisierungspuffer
- Hybridisierungspuffer
- Lösungen sollten gehalten RNase-frei sein. Verwenden Sie entweder Glas-ware, die gebacken hat (4 Stunden bei 250 ° C) oder Einweg-Kunststoff. Serologische Pipetten sind sehr nützlich für die Herstellung von Lösungen
- Dissect Flügel von Zeit inszenierte Puppen in PBS
- Bewegen Flügel direkt auf Buffer in Vertiefungen von 24-Well-Kulturplatte Fix bei Raumtemperatur
- Fix-Discs für 2 Stunden
- Wash 5 x 5 Minuten in PBT
- Inkubieren Flügel für 3 Minuten in Proteinase K-Lösung
- Spülen Sie 2 x in der Verdauung Anschlagpuffer
- Wash 5 x 5 Minuten in PBT
- Wash 2 x 5 Minuten in 50:50 PBT: PHB
- Wash 1 x 10 Minuten in PHB
- Inkubieren in PHB mindestens 1 Stunde bei 55 ° C.
- Heat-denaturieren RNA-Sonde (20-50ng pro Well benötigt) (80 ° C für 5 Minuten) und fügen Sie Hybridisierungspuffer (100 ul pro Well benötigt)
- Add-Sonde in die Vertiefungen und inkubieren 48 Stunden bei 55 ° C
TAG 3
- Wash 4 x 5 Minuten in 55 ° C PHB
- Inkubieren über Nacht in PHB bei 55 ° C
TAG 4
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
- Antikörper Blockpuffer
- Wash 1 x 5 Minuten in 50:50 PBT: PHB
- Wash 4 x 5 Minuten in PBT
- Inkubieren Flügeln für 1 Stunde in Blockpuffer bei 4 ° C
- Inkubieren Flügel in einer 1:2000 Verdünnung von Anti-Dig-Antikörper über Nacht bei 4 ° C
TAG 5
- Bereiten Sie folgende Lösungen:
- Erkennung Buffer
- Entwickeln Solution - lichtempfindlich (wrap in Folie)
- Wash 3 x 5 Minuten in PBT bei Raumtemperatur
- Wash 7 x 5 Minuten in PBT
- Spülen Flügel zwei Mal in Detektionspuffer
- Develop Flügel in 1 ml der Entwicklung Solution - Zeit der Entwicklung muss jedes Mal kontrolliert werden - die Entwicklung von Zeiten können auch geändert werden, wenn die gleichen Sonden-und Entwicklungsländern Lösung - in der Regel nach 5-10 Minuten zu überprüfen und dann zu erhöhen Abständen bis zu übernachten. Platte sollte in Folie gewickelt werden, um Belichtung zu verhindern, wenn nicht die Überprüfung von Proben.
- Spülen Sie fünf Mal in Entwicklungsländern Anschlagpuffer
- Berg Flügel.
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Diskussion
Optimierung bestehender Protokolle
In situ Hybridisierungen auf Larven Flügel Scheiben erfolgreich durchgeführt wurden mit Scheiben aus Precis coenia Schmetterlinge (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. Das derzeitige Protokoll hat sich von einer ausführlichen schriftlichen Protokoll auf Anfrage von der Carroll Lab für die Larven Flügel Färbungen angepasst. Die Veränderungen, die wir gemacht dienen, um Unterschiede zwischen Larven-und Puppenstadium Flügel Gewebe aufnehmen. Während Puppenstadium Hinterflüge...
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Danksagungen
Wir danken Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche Technical Support, um Hilfe bei der Fehlersuche dieses Protokoll. Wir danken auch William Piel um Rat bei der Bearbeitung des Films.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Fixierpuffer | 4% Paraformaldehyd in PBS | |||
| PBT | 0,1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase-K-Lösung | 2,5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Puffer zur Beendigung der Verdauung | 2 mg/ml Glycin in PBT | |||
| Vor-Hybridisierungspuffer | Für 50 ml PHB: 12 ml DEPC-behandeltes Wasser + 25 ml Formamid + 12,5 ml 20 x SSC + 50 µl Tween 20 + 500 µl 10 mg/ml Lachssperma (RNase-frei, vor Zugabe zur Lösung hitzedenaturiert). | |||
| Hybridisierungspuffer | 1 mg/ml Glycogen zum Vor-Hybridisierungspuffer hinzufügen | |||
| Blockpuffer | 50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkalische Phosphatase-konjugiert |
| DIG-Wasch- und Blockierpuffer-Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount, wässriges Einbettmedium | Sigma-Aldrich | C0612 | Einbettmedium |
Referenzen
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
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Nachdrucke und Genehmigungen
