Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Summary

Toxoplasma gondii verwandelt sich in eine Zyste bilden als Reaktion auf Belastungen der Umwelt, die in Gewebekultur-Modellen nachgeahmt werden kann. Dieses Video zeigt Techniken, um Zystenwand Bildung durch Aktivierung des Knochenmarks-Makrophagen oder Ändern Wachstumsmedium pH in Fibroblasten-Zellen zu untersuchen.

Abstract

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazelluläre Parasiten, die jeder kernhaltigen Zelle des Warmblüter eindringen können. Während der Infektion, T. gondii verbreitet als schneller replizierende Form genannt tachyzoite. Tachyzoiten in eine langsam wachsende encystierten Form genannt bradyzoite durch eine Signalisierung, die nicht gut charakterisiert konvertieren. Innerhalb Tiere sind bradyzoite Zysten in das zentrale Nervensystem und Muskelgewebe und stellen die chronische Phase der Infektion. Die Umstellung auf Bradyzoiten können in Gewebekultur simuliert CO ₂ Hunger, mit Medium mit hoher pH-Wert oder die Zugabe von Interferon-gamma (IFN &ggr;). Bradyzoiten werden durch die Anwesenheit einer Zystenwand, zu denen das Lektin Dolichos biflorus Agglutinin (DBA) bindet charakterisiert. Fluoreszenzmarkierten DBA wird die Zystenwand in Parasiten im menschlichen Vorhaut-Fibroblasten (HFFS), die zu niedrigen CO ₂ und hoher pH-Milieu ausgesetzt waren, gewachsen zu visualisieren. Ebenso, wohnhaft Parasiten in murinen Knochenmark-Makrophagen (BMMS) zeigt eine Zystenwand nachweisbar durch DBA nach dem BMMS mit IFNy und Lipopolysaccharid (LPS) aktiviert werden. Dieses Protokoll wird zeigen, wie die Umwandlung von T. induzieren gondii zu Bradyzoiten mit einem hohen pH-Wachstumsmedium mit niedrigem CO ₂ und die Aktivierung der BMMS. Wirtszellen wird auf Deckgläsern kultiviert werden, infiziert mit Tachyzoiten und entweder mit Zugabe von IFN &ggr; und LPS (BMMS) aktiviert oder die von einem hohen pH Wachstumsmedium (HFFS) für drei Tage. Nach Abschluss der Infektionen wird Wirtszellen fixiert, permeabilisiert werden, und blockiert. Cyst Wände werden visualisiert Rhodamin DBA mit Fluoreszenzmikroskopie.

Protocol

1. Vorbereitung der menschlichen Vorhaut-Fibroblasten (HFF)-beschichteten Deckgläschen

1. Legen Sie eine sterile runde Deckglas auf dem Boden der Wells einer 24-well Zellkulturschale.
2. Zur Ernte HFFS aus einer konfluenten 150cm ² Flasche, spülen Sie die Flasche zweimal mit 1X PBS und 2,5 ml von 0,025% Trypsin-EDTA. Inkubieren Kolben bei 37 ° C für 5-10 Minuten.
3. Tippen Sie auf die Seite der Kolben gegen die Handfläche in Ablösen der Zellen aus der Flasche zu unterstützen. Sobald Zellen aus dem Kolben gelöst, fügen Sie 150 ml der HFF Medium (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Strept....

Discussion

Während der Mechanismus der bradyzoite Entwicklung ist noch nicht vollständig verstanden, molekulargenetische Analysen von T. gondii Bühne Umwandlung in Gewebekultur hat zur Entdeckung von Genen, die in bradyzoite Zystenbildung ^2,3,4 beteiligt sind geführt. Die Analysen auch auf die Beobachtung, dass einige bradyzoite Marker in anderen längeren Stress-Bedingungen, einschließlich des Wachstums in aktivierten Makrophagen ^5,6 ausgedrückt werden geführt. Die oben genannten Methoden beschreiben.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	GIBCO, von Life Technologies	11960-051
Fetales Rinderserum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Hitzeinaktivierung
von Rhodamin Dolichos biflorus Agglutinin	Vector Laboratories	RL-1032
Formaldehyd (16%)	Polysciences, Inc.	18814
Glycin	Fisher Scientific	BP381-5
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
IFNγ	PeproTech Inc	315-05	In Einweg-Aliquoten
aufbewahren L-Glutamin (200mM)	GIBCO, von Life Technologies	25030
Lipopolysaccharid (LPS)	Sigma-Aldrich	L4391-1MG	In Einweg-Aliquoten aufbewahren
Mikroskop Deckglas	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, von Life Technologies	15140
RPMI Medium 1640 Pulver (mit L-Glutamin, ohne Bicarbonat)	GIBCO, von Life Technologies	31800-022
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Trypsin-EDTA (0,25%)	GIBCO, von Life Technologies	25200
VectaShield Einbettmedien mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200